DNA甲基化在豬胚胎發育過程中的研究進展

甘建宇，張 芯，蔡更元，洪林君，黃思秀

(華南農業大學動物科學學院 國家生豬種業工程技術研究中心，廣州 510642)

豬在體型、生理和基因組特征上與人類相似，被認為是人類疾病研究的最佳動物模型。作為主要的產肉家畜，商品豬的產仔數一直以來都是重要的經濟指標，而產仔數的多少與胚胎是否能發育正常有著重要的聯系。豬的胚胎發育是一個復雜的生理過程，需要經歷一系列重要的生理階段以及自發胎兒丟失、宮內生長受限等嚴峻的考驗后才能幸運地發育成新生兒，這導致了豬胚胎產前死亡率高達20%～45%。雖然在胚胎發育過程中基因的嚴格表達與正確指導是胚胎能否正常發育的決定性條件，但是近年來的研究發現，表觀遺傳調控對胚胎的發育也起著必不可少的作用。

表觀遺傳學是指細胞核DNA序列沒有改變的情況下，個體全基因組功能發生可遺傳和可逆的改變。研究表明，表觀遺傳修飾并不局限于生物體的特定生命階段，而是貫穿整個生命周期。然而，它們更常見于胚胎發育和細胞增殖階段。在生殖細胞和早期胚胎中，表觀遺傳重編程發生在全基因組范圍內。通過這些表觀遺傳機制，細胞整合環境刺激來協調基因轉錄，基因表達等生理過程，對豬的胚胎發育至關重要。本文總結了目前研究得最成熟的表觀遺傳修飾——DNA甲基化，在豬胚胎發育過程中的研究進展，為今后進一步了解和研究DNA甲基化及其與其他表觀遺傳修飾的串擾在胚胎發育的作用提供借鑒和參考。

1 豬胚胎在妊娠期間的發育過程

受精卵的形成標志著哺乳動物胚胎發育的開始。在最初的4 d里，豬的胚胎獨立于母體環境進行卵裂分裂，儲存在卵母細胞中的編碼細胞周期和核酸合成調節因子的mRNA和蛋白質維持著這一早期胚胎發育。但大約在第3天(4細胞期)時，胚胎基因組開始激活，隨后自主指導自身的發育，直到囊胚形成。

大約在受精后第7天，胚胎從透明帶中孵化出來，隨后繼續增殖發育，第10天時直徑擴大到2～6 mm。從妊娠第10天開始，胚胎的形態開始發生劇烈變化，從球狀囊胚首先轉變成管狀胚胎，然后在妊娠第12天左右發育成絲狀(100～150 mm)，并進一步伸長，在妊娠第16天左右達到了1 000 mm。伸長后的胚胎能顯著增加與子宮內膜的接觸面積，從而為胚胎后續的附植提供了條件。

妊娠第11～13天是妊娠識別的關鍵時期，此階段胚胎開始分泌能啟動胚胎-母體識別的信號——雌二醇來完成識別過程。成功進行妊娠識別后，胚胎開始進入附植窗口期，并在妊娠第18天左右完成附植過程。此時胚胎滋養層上皮與子宮腔上皮相互黏附，胎盤開始建立。大約在妊娠28 d，胎盤完全形成，標志著豬的妊娠早期階段結束。

在妊娠中期時，胎盤基質層的厚度顯著增加，并且形成褶皺結構。褶皺的形成大大增加了胎盤與母體子宮的接觸面積，從而使營養物質的運輸效率顯著提高，為胎兒的進一步發育提供了條件。進入妊娠中期后，胎兒中已分化的器官繼續發育完善，體重在妊娠后期迅速增加，并在分娩前體重達到最高水平。豬的胚胎發育過程中的其他重要事件總結如圖1所示。

EGA. 胚胎基因組激活；pPGCs. 豬原始生殖細胞EGA. Embryonic genome activation; pPGCs. Porcine primordial germ cells圖1 豬胚胎發育過程中重要事件Fig.1 The crucial events during porcine embryonic development

2 DNA甲基化與胚胎發育

2.1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是一種常見且重要的表觀遺傳修飾，雖然不改變 DNA 的一級序列，但也包含可遺傳信息，并在基因的轉錄調控中起重要作用。3種不同的DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase, DNMT)DNMT1、DNMT3a和DNMT3b催化DNA甲基化，其中DNMT1是主要的維持甲基化酶，DNMT3a和DNMT3b則負責從頭甲基化。而近年來發現DNMT1在卵母細胞中也可以介導從頭甲基化的過程。當甲基以時間和空間的精度被添加到除位于CpG島上的CpG二核苷酸中的5′-胞嘧啶殘基位置時，部分生物學過程會隨之被改變，例如基因轉錄、基因組印記、組織分化和表型變異。此外，在非CpG位點也發現了DNA甲基化，這被稱為非CpG甲基化，可由DNMT3a和DNMT3b介導。目前已經在人類胚胎干細胞中發現了非CpG甲基化的存在。

2.2 豬早期胚胎發育中DNA甲基化的動態過程

DNA甲基化在分化的體細胞中相對穩定，但在哺乳動物的早期胚胎發生中是高度動態的。在受精過程中，高度甲基化的精子(內含父本基因組)經歷了快速的主動去甲基化過程，這一過程主要由tet甲基胞嘧啶雙加氧酶(tet methylcytosine dioxygenase, TET)來介導。由于DNMT1不能進入細胞核，因此隨著胚胎繼續發生卵裂，其去甲基化繼續以被動的形式發生，并在囊胚中達到整個胚胎發育過程的最低水平。從頭甲基化(methylation)是早期胚胎發育的主要DNA甲基化模式，在DNMT3a和DNMT3b的介導下從豬的早期囊胚(受精后第5天)開始，并在附植期間建立。有報道還觀察到了在第7～8天的囊胚中出現系譜特異性的DNA甲基化，其中甲基化的主要部位是內細胞團，其次是滋養外胚層。胚胎在附植前發生的第一次DNA甲基化重編程(DNA methylation reprogramming，DMR)消除了配子發生過程中所積累的與分化相關且不必要的表觀遺傳信息，從而使胚胎獲得了能獨立發育成一個新個體的多能性。與小鼠和人一樣，豬在pPGCs分化形成后不久也會發生第二次DMR，并且這一過程所持續的時間較長。在從后腸遷移到性腺脊期間(妊娠約15～22天)，高度甲基化的pPGCs開始去甲基化，并在第20天左右達到較低水平，隨后開始重新升高，在28天時重新達到一個較高水平。但在28天后，PGC中的甲基化程度重新降低，并在妊娠中期的第36天左右達到第二個低水平，隨后繼續升高，在第42天時恢復至第28天左右的水平(圖2)。隨著上一代建立的DNA甲基化印記的消除，DNA甲基化模式在胚胎發生過程中通過DNMT3a和非催化旁系同源物DNMT3L在印記基因座和轉座因子上重新建立。重編程的去甲基化過程涉及5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5 mC)的修飾和DNA修復。在這一過程中，5 mC修飾可以通過不同的機制(例如TET1介導的羥基化)來介導，從而啟動主動去甲基化過程。但與第一次全基因組DMR不同，pPGCs中的DMR只是局部基因組的去甲基化和擦除，并根據胎兒的性別形成了印記。有研究發現，在妊娠第30和第45天豬胚胎的1(<0.01)、3和3(<0.05)表達均高于成年組織，這不僅與pPGCs中甲基化程度的動態變化相適應，并且與前人研究的1功能以及發現小鼠3a和3b在未分化的胚胎干細胞中高表達的事實相一致，表明豬胚胎內DNA甲基化的動態過程與其他哺乳動物之間是具有廣譜性的。

圖2 豬胚胎發育過程中DNA甲基化的動態變化Fig.2 Dynamic changes in DNA methylation during porcine embryonic development

-甲基脫氧腺嘌呤(-methyldeoxyadenosine, 6 mA)是一個在原核生物中研究得較多的DNA甲基化標記，主要被原核生物用來保護自身基因組免受外來DNA的入侵。由于其豐度極低和技術限制的原因，過去人們難以檢測到真核生物DNA中的6 mA，對真核生物中的6 mA的關注度一直以來都十分有限。隨著檢測技術的提高， 6 mA修飾不僅在果蠅、斑馬魚的胚胎發生過程中被檢測到，而且在哺乳動物如小鼠和豬的胚胎發育過程中呈現出動態變化，并被發現在哺乳動物胚胎干細胞發育和分化過程中發揮關鍵作用。在豬早期胚胎發生過程，特別是處于全基因組DNA去甲基化時期的4-細胞期和桑葚胚階段也積累到了相對較高的豐度水平(6 mA/A的比例達到了0.1%～0.2%)，此階段對應豬胚胎發育的EGA事件。隨后6 mA的豐度迅速降低，這與He等發現的6 mA在果蠅EGA期間豐度的變化趨勢基本一致，因此認為，6 mA的正常修飾可能在豬早期EGA事件中的表觀遺傳重編程過程中起著重要作用，其調控機制或許與果蠅基本相同。有人提出DNA中的6 mA修飾具有調節DNA結構和轉錄以及跨代傳遞信息等表觀遺傳調控功能，并且有可能在植入前胚胎和pPGCs中起到補充5 mC的抑制作用。但在豬胚胎發育過程中6 mA是否也具有這些功能，需要更多的研究來驗證。

2.3 DNA甲基化對豬SCNT的胚胎發育影響

近年來，隨著全球首例豬心移植和豬腎移植的成功，豬作為人體器官移植潛在的主要提供者受到越來越多的關注。異種器官移植的前提是需要構建適當的基因修飾豬，而體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT)一直以來都是構建基因修飾豬的重要方法，能將分化細胞快速重編程為全能胚胎，在養豬業、人類生物醫學和生命科學中具有重要的應用價值。然而，只有約1%的成功率(出生克隆仔豬數量/移植克隆胚胎數量)使得SCNT的進一步應用受阻，這與早期豬SCNT胚胎中全基因組DNA甲基化的動態模式異常有著密不可分的聯系。

提高SCNT的成功率的辦法之一是把供體細胞DNA甲基化水平降低到全能胚胎細胞的水平。因此，抑制供體細胞中DNA甲基化酶的活性是提高SCNT胚胎發育成功率的一個重要方法。研究發現，供體細胞中的Dnmt1 s(Dnmt1的一種體細胞形式亞型)是SCNT介導的DNA甲基化重編程的障礙，損害了克隆胚胎的發育。當Dnmt1 s被敲除后，其自身和克隆胚胎基因組的甲基化被重建，與多能性有關的基因的表達也得到了顯著提高。提高DNA去甲基化酶的活性也可以達到降低DNA甲基化水平的效果。例如克隆胚胎中過表達甲基-CpG結合結構域蛋白(methyl-CpG-binding domain proteins, MBD)中的MBD3(一種能觸發DNA去甲基化的酶)能顯著改善克隆胚胎的囊胚率和每個囊胚的細胞數以及降低與多能性有關的基因啟動子的DNA甲基化水平。此外，供體細胞的類型和表觀遺傳修飾模式也會顯著影響SCNT胚胎的發育能力。例如豬骨髓間充質干細胞由于只有部分分化，因此相比于豬胚胎成纖維細胞(porcine embryonic fibroblast, pEF)更容易重新編程為多能狀態。Zhai等發現，來自豬骨髓間充質干細胞的SCNT胚胎比來自pEF的SCNT胚胎擁有更多的活躍表觀遺傳標記和較少的抑制性表觀遺傳標記，其和51(與胚胎多能性有關的兩個基因)的啟動子區域DNA甲基化水平均低于pEF的SCNT胚胎，且染色質狀態更活躍，因此擁有更高的卵裂率和囊胚率。

SCNT技術的成功率難以提高也與印記基因的表達異常有關。豬SCNT胚胎發育異常和印記基因19和2的甲基化異常有著密不可分的聯系，因此，一些能挽救19和2甲基化異常狀態的物質(例如Trichostatin A(TSA)、RG108和scriptaid)或維持19和2甲基化正常的基因(例如tripartite motif containing 28(TRIM28))都能間接影響SCNT的胚胎發育狀態。此外，Yu等對豬的誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)和相關的克隆胚胎進行了甲基化組和轉錄組分析，發現印記基因的異常沉默，特別是反轉錄轉座子衍生的印記基因retrotransposon Gag like 1(1)的沉默，是導致妊娠失敗的主要原因之一。若恢復1在iPSCs中的表達可以挽救胎兒的丟失。因此,1在動物克隆中或許是反映供體細胞印記狀態的一個很好的標記物。但在豬中，目前只有少數印記基因的調控機制被研究過，而胚胎發育過程可能受一個復雜而協調的印記基因網絡的調節。因此，深入研究印記基因的具體分子機制，揭示這一調控網絡對提高SCNT技術的成功率來說具有重要意義。

其他表觀遺傳修飾類型也能影響供體細胞的DNA甲基化水平，例如miR-148A被證明可以通過靶向抑制pEF的1表達，從而降低SCNT胚胎的DNA甲基化整體水平，增強SCNT胚胎的發育潛力。一些組蛋白甲基化抑制劑也被發現不但可以改變組蛋白的甲基化程度，而且可以抑制供體細胞的DNA甲基化水平，從而提高SCNT的成活率和囊胚率，這也提示可以聯合調節不同表觀遺傳修飾類型(例如同時降低DNA甲基化和組蛋白甲基化水平)來進一步提高SCNT胚胎的克隆成活率。近年來發現的能夠改善SCNT胚胎成活率的物質如表1所示。

表1 影響SCNT胚胎DNA甲基化水平的物質Table 1 Substances that can affect the level of DNA methylation in SCNT embryos

2.4 孕期母體營養對胚胎DNA甲基化的影響

孕期母體營養可通過改變后代的表觀遺傳修飾影響后代的基因表達。在妊娠早期營養攝入不足或過量都有可能會影響子宮內膜或胎兒的DNA甲基化程度，從而影響胎兒的正常發育。例如，Altmann等發現，母豬攝入蛋白過高或過低會導致妊娠第95天的胎兒肝中1和3b的基因表達變低，并且導致全基因組甲基化水平降低。而肌肉組織則不太相同。相比于對照組來說，高蛋白日糧組的胎兒的1和3a的表達顯著增加，低蛋白日糧的胎兒中3a表達顯著降低。此外，如果在母豬的整個妊娠期間飼喂添加了與DNA甲基化有關的微量元素葉酸、維生素B和B、蛋氨酸、膽堿和鋅的日糧會使雄性胎兒在妊娠后期體重增加，但出生后體重下降，并伴隨著由肌源性關鍵驅動因子(Pax7、MyoD1、mygenin)組成的代償性轉錄反應，但在雌性胎兒中卻沒有這一現象。這說明母體營養的改變在胎兒不同的組織和性別內所造成的DNA甲基化的改變程度是不盡相同的，而其具體的發生機制或許也有所差異。

一份基因表達微陣列測序結果表明，在短而獨特的圍孕期(妊娠1～9 d)對母豬進行限飼(比正常飼喂量減少30%)會改變圍附植期胚胎中大量基因的表達(496個基因的表達上調，291個基因的表達下調)，其中就包括了1表達的顯著降低。進一步研究表明，這一期間的限飼可以使胚胎在圍附植期中1的甲基化水平以及28和57的mRNAs和蛋白總豐度升高。這3個基因都是DNA甲基化維持的重要基因，說明母豬圍孕期限飼會對圍附植期豬胚胎的DNA甲基化水平產生較大的影響。相類似地，圍孕期限飼也能影響母豬子宮內膜中與DNA甲基化有關的基因的表達。目前已發現限飼組中的子宮內膜1、3a、28和57的表達水平均顯著降低。這說明圍孕期的營養不良有可能影響了子宮內膜的DNA從頭甲基化和甲基化維持過程，并有可能對胎兒的生長發育產生影響。這些研究提示，應做好母豬妊娠期間的營養保育工作。

此外，有研究發現，對受體母豬進行營養管理也是提高克隆豬胚胎發育率的有效途徑。若在妊娠14～75天日糧添加L-精氨酸，能提高移植克隆豬胚胎受體母豬血漿中精氨酸和精氨酸代謝產物(包括一氧化氮、亞精胺和腐胺)的濃度，從而提高受體母豬的妊娠率，并顯著提高了克隆仔豬出生總數占移植克隆豬胚胎總數的比例。這也提示了提高克隆豬的囊胚率和生存率可以通過改善受體母豬的營養管理方式這一途徑。

3 總結與展望

在豬的胚胎發育中，DNA甲基化的動態修飾起著必不可少的調節作用。若DNA甲基化發生異常，可能會造成胚胎發育受阻甚至是畸形或死亡，而這也是SCNT和體外生殖胚胎成活率低的主要原因之一。此外，對于孕期母體的營養狀況調控也會通過DNA甲基化對胚胎造成影響。因此，對DNA甲基化進行深入研究，了解早期豬胚胎中DNA甲基化的異常全基因組動態模式，能為提高豬胚胎的成活率提供借鑒。此外，不同類型的表觀遺傳調控，如DNA甲基化、組蛋白修飾等已有較好的獨立研究，然而不同表觀遺傳修飾之間更表現出相互作用，從而構成調控網絡的可能。目前，DNA 甲基化和組蛋白修飾途徑已被發現可以相互發生串擾。因此，在未來深入了解豬胚胎在發育過程中DNA甲基化與其他表觀遺傳修飾途徑的相互作用機制對于提高豬的產仔數和在人類生物醫學以及生命科學中的應用價值仍是非常重要的。