微濾-超濾聯用技術優化牛初乳乳清中IgG富集工藝

陳文璐，劉妍妍, ，鄧 凱，耿思緣

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江惠豐乳品有限公司，黑龍江大慶 163316；3.大連產品質量檢驗檢測研究所有限公司，遼寧大連 116000）

牛初乳是指健康母牛分娩后7 d內特別是3 d內分泌的乳汁，其蛋白質、脂肪、無機鹽、維生素等含量明顯高于常乳，且營養價值高出普通牛乳幾倍到幾十倍，對人類更有意義的是它含有大量的免疫因子（主要為IgG）和生長因子等活性成分，對提高人體免疫力、預防疾病具有獨特的作用，因而被譽為“21世紀的保健食品”。目前，我國1～3 d牛初乳年產量約為20.2萬噸，除哺喂犢牛外，約1/2可供加工利用。但由于牛初乳中干物質含量高，黏度較大，有苦味甚至有異臭味，加熱易變性凝固等因素嚴重影響牛初乳產品發展，目前我國只停留在牛初乳的簡單處理上，生產企業的規模較小，產品種類單一，另外，直接進行低溫噴霧干燥和冷凍干燥生產初乳粉，生產成本較高，而且產品中活性成分IgG的含量較低。因此如何改善牛初乳企業的生產現狀，降低生產成本，提高牛初乳產品中的IgG含量，是實現大規模工業化生產亟須解決的問題。

膜分離技術是一種新型的非熱綠色環保技術，可最大限度地保留乳品的營養價值，尤其是對于熱不穩定的營養物質，比如免疫因子、維生素等物質。現已應用到乳品行業的膜分離技術有微濾（MF）、超濾（UF）、納濾（NF）、反滲透（RO）和電滲析（ED）等，可部分取代傳統過濾、吸附、重結晶、濃縮、蒸餾、殺菌等工藝。有研究表明，通過微濾技術可去除乳清中的脂肪和細菌，得到蛋白含量達90%以上的分離乳清蛋白，劉飛云等使用膜孔徑1.2 μm的陶瓷膜，在壓力為0.12 MPa，溫度為50 ℃的條件下，細菌的除菌率達到99%以上，芽孢的去除率達到95%以上。劉愛國等用鹽析-超濾的方法提取純化牛血清中的免疫球蛋白，得率為9.378 mg/mL，回收率為91%。羅磊采用截留分子量為100 kDa的聚醚砜膜提取豬血中IgG，純度為68.2%，活性為87.6%，根據工藝的不同可將膜進行組合以獲得最大成效。

針對國內牛初乳資源利用率低、產品種類單一，功效不穩定等問題。本研究擬以脫脂牛初乳乳清為原料，采取微濾-超濾聯用技術對牛初乳乳清中的IgG進行富集，從而開發出具有免疫調節功能的富集IgG牛初乳乳清產品，可直接飲用或添加到其他液態奶產品中，進而開發出新型功能性產品，促進牛初乳功能液態奶產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛初乳 黑龍江省完達山乳業有限公司；凝乳酶（酶活力為10 萬U/g） 生化試劑，深圳市富晟生物科技有限公司；牛免疫球蛋白（IgG）酶聯免疫試劑盒 上海分細生物科技有限公司；pH7.2磷酸鹽緩沖液、平板計數瓊脂（PCA） 杭州微生物試劑有限公司；氫氧化鈉、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、三聚磷酸鈉、冰乙酸、乙酸鈉、無水乙醚等均為國產分析純。

實驗室膜分離裝置 吉林海普科技發展有限公司；JY2502 電子天平 鄭州南北儀器設備有限公司；HH-6 數顯恒溫攪拌水浴鍋 金壇市城東新瑞儀器廠；TD5A-WS 離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；Sunrise 酶標儀 奧地利TECAN公司；SHP-250生化培養箱 上海森信試驗儀器有限公司；LDZM-802KCS 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；DL-CL-2ND 超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；K9840 自動凱式定氮儀 奧豪斯儀器（常州）有限公司；WH-2渦旋混合器 金壇市美特儀器制造公司；DGG-9140A電熱鼓風干燥箱 上海森信公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛初乳乳清的制備 采集新鮮的牛初乳經紗布過濾，去除所含的細胞組織和采集過程中摻入的雜質，然后在4 ℃，4000 r/min條件下離心20 min，去除上層分離出來的脂肪層，再經紗布過濾得到脫脂牛初乳。

向脫脂后的牛初乳中添加3‰的凝乳酶后迅速攪勻，在34 ℃的水浴鍋中進行恒溫凝乳，待其全部凝結并有輕微的乳清析出時凝乳結束，冷卻攪拌均勻后，在4 ℃，4000 r/min條件下離心30 min，將離心后用紗布過濾，得到牛初乳乳清。

1.2.2 膜的清洗 膜處理前對管路和膜組件用去離子水清洗30 min，再用70～75 ℃去離子水殺菌20 min，然后開始試驗。試驗完成后用去離子水清洗30 min，再采用1% NaOH溶液在50 ℃下反向清洗30 min，用以清洗膜中截留的蛋白，最后使用去離子水清洗至中性。

1.2.3 牛初乳乳清微濾除菌的工藝優化 回收1.2.1處理得到的牛初乳乳清，經0.2 μm孔徑的陶瓷膜（膜面積0.07 m）過濾，截留乳清中的細菌。

1.2.3.1 不同微濾壓力對微濾除菌效果的影響 選取微濾壓力 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 MPa，在料液溫度30 ℃的操作條件下，對牛初乳乳清進行除菌，將過濾后回收的截留液用去離子水稀釋到原來體積，再次過濾，提升透過液蛋白含量。收集微濾的透過液，以菌落總數、IgG保留率和膜通量為指標，確定最佳的微濾壓力。

1.2.3.2 不同料液溫度對微濾除菌效果的影響 選取料液溫度20、25、30、35、40 ℃，在微濾壓力0.15 MPa的操作條件下，對牛初乳乳清進行除菌，將過濾后回收的截留液用去離子水稀釋到原來體積，再次過濾，提升透過液蛋白含量。收集微濾的透過液，以菌落總數、IgG保留率和膜通量為指標，確定最佳的料液溫度。

1.2.4 超濾富集IgG的單因素優化 回收1.2.3微濾得到的牛初乳乳清溶液，選用100 kDa孔徑的卷式聚醚砜膜（膜面積0.32 m）。

1.2.4.1 不同超濾壓力對超濾濃縮效果的影響 選取超濾壓力 0.075、0.100、0.125、0.150、0.175 MPa，在料液溫度30 ℃，濃縮5倍，3次稀釋濃縮的操作條件下，對牛初乳乳清溶液進行超濾濃縮，收集超濾的截留液和透過液，以IgG濃縮率和膜通量為指標，確定最佳的超濾壓力。

1.2.4.2 不同料液溫度對超濾濃縮效果的影響 選取料液溫度 20、25、30、35、40 ℃，在壓力 0.1 MPa，濃縮5倍，3次稀釋濃縮的操作條件下，對牛初乳乳清溶液進行超濾濃縮，收集超濾的截留液和透過液，以IgG濃縮率和膜通量為指標，確定最佳的料液溫度。

1.2.4.3 不同濃縮倍數對超濾濃縮效果的影響 選取濃縮倍數 4、5、6、7、8倍，在壓力 0.1 MPa，料液溫度30 ℃，3次稀釋濃縮的操作條件下，對牛初乳乳清溶液進行超濾濃縮，收集超濾的截留液和透過液，以IgG濃縮率和膜通量為指標，確定最佳的濃縮倍數。

1.2.4.4 不同稀釋次數對超濾濃縮效果的影響 選取稀釋次數 1、2、3、4、5次，在壓力 0.1 MPa，料液溫度30 ℃，濃縮5倍的操作條件下，對牛初乳乳清溶液進行超濾濃縮，收集超濾的截留液和透過液，以IgG濃縮率和膜通量為指標，確定最佳的稀釋次數。

1.2.5 超濾富集IgG的響應面優化 在單因素實驗結果的基礎上，選取超濾壓力、濃縮倍數、稀釋次數為因素，根據Box-Behnken設計實驗原理進行響應面法優化，通過分析和建立數學模型來確定超濾富集IgG的最佳工藝參數，響應面試驗設計如表1所示。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 檢測分析方法

1.2.6.1 菌落總數的測定 參照食品安全國家標準GB 4789.2-2016中的平板計數法進行測定。

1.2.6.2 酶聯免疫吸附法測定IgG活性和含量 采用牛免疫球蛋白（IgG）酶聯免疫分析試劑盒，其步驟參考試劑盒說明書進行。

IgG活性線性回歸得標準曲線為：y=243.8082x-0.5984（y：吸光度；x：IgG 標準品的活性為橫坐標（IU/L））=0.9976。根據標準曲線計算IgG活性。

IgG含量線性回歸得標準曲線為：y=0.0172x+0.0032（y：吸光度；x：IgG 標準品的濃度為橫坐標（μg/mL））=0.9972。根據標準曲線計算IgG保留率和IgG濃縮率，分別按公式（1）和（2）計算。

式中：C：微濾后 IgG 濃度，μg/mL；C：初始IgG 濃度，μg/mL。

式中：C：濃縮后 IgG 濃度，μg/mL；C：微濾后IgG 濃度，μg/mL；C：初始 IgG 濃度，μg/mL。

1.2.6.3 膜通量的測定 一定的操作壓力下，計算單位時間內通過單位膜表面的流體體積，膜通量的計算公式如下。

式中：J：通量，L/m·h；V：過濾液體積，L；A：面積，m；t：過濾時間，h。

1.2.6.4 蛋白質含量的測定 參照食品安全國家標準GB 5009.5-2016中的凱氏定氮法進行測定。

1.2.6.5 脂肪含量的測定 參照食品安全國家標準GB 5009.6-2016中的索氏抽提法進行測定。

1.3 數據處理

試驗所得數據利用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，采用 Origin Pro 8.5 進行繪圖，采用 Design-Expert 10.0.1 軟件進行試驗設計及分析。試驗數據均為三次平行試驗的均值。

2 結果分析

2.1 微濾除菌工藝參數結果與分析

2.1.1 微濾壓力對透過液除菌效果、IgG保留率以及膜通量的影響 由圖1可知，隨著微濾壓力的增加，菌落總數對數值呈下降趨勢，除菌率＞99.9%，微濾透過液中IgG保留率先上升后急劇下降，膜通量先上升再下降后上升，這可能是因為壓力在0.05～0.2 MPa時，隨壓力增大牛初乳乳清對沉積層的剪切力增大，從而膜通量相應增大，但當壓力繼續增大時，吸附和沉積物的沉降速率增大，并且大于牛初乳乳清膜面的剪切力，濾孔的有效孔徑縮小，造成膜孔堵塞和膜面濃差極化，膜通量降低，并進一步導致蛋白顆粒的截留。當壓力增大至最大0.25 MPa時，微濾透過液中IgG保留率較低，說明微濾膜表面可快速形成濾餅層阻止IgG分子的滲透，然而微濾（壓力0.25 MPa）過程中水分子的有效推動力大于沉積層的阻力，進而導致通量反而上升。因此，綜合考慮微濾壓力對除菌效果、IgG保留率以及膜通量的影響，確定微濾壓力為0.20 MPa。

圖1 微濾壓力對菌落總數、IgG保留率和膜通量的影響Fig.1 Effect of microfiltration pressure on total bacterial count,IgG retention rate and membrane flux

2.1.2 料液溫度對透過液除菌效果、IgG保留率以及膜通量的影響 由圖2可知，隨著微濾系統料液溫度的上升，菌落總數對數值在逐漸降低，而IgG保留率和膜通量隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，主要是因為溫度較低牛初乳乳清的粘度較大，蛋白顆粒堵塞微濾膜，使濾孔的有效孔徑縮小，導致膜通量降低，并進一步導致蛋白顆粒的截留。隨著溫度的上升，分子擴散系數增大，牛初乳乳清粘度降低，組分溶解度增大，因此膜通量提高，蛋白截留率降低，IgG保留率升高，當溫度達到35 ℃時，乳清中蛋白質易發生聚集，導致膜表面蛋白濃度過高而造成大量蛋白吸附在膜表面，導致膜通量和IgG保留率降低。因此，綜合考慮料液溫度對除菌效果，IgG保留率以及膜通量的影響，確定微濾料液溫度為30 ℃。

圖2 料液溫度對菌落總數、IgG保留率和膜通量的影響Fig.2 Effect of feed liquid temperature on total bacterial count,IgG retention rate and membrane flux

2.2 超濾富集IgG的單因素實驗結果與分析

2.2.1 超濾壓力對截留液IgG濃縮率及膜通量的影響 由圖3可知，IgG濃縮率和膜通量隨著超濾壓力的增加呈現上升趨勢，當超濾壓力為0.150 MPa時，此時IgG濃縮率和膜通量均達到最高，分別為44.79%、190.54 L/m·h，隨著操作壓力的繼續增加，IgG濃縮率和膜通量呈現下降的趨勢。這是因為壓力在0.075～0.150 MPa時，隨著超濾壓力的增加，膜系統中的推動力也不斷增加，從而提高了IgG濃縮率和膜通量。但當壓力增加到一定程度，牛初乳乳清在系統中聚集于膜表面，高濃度的蛋白形成結締組織吸附于膜表面，形成凝膠層，阻塞膜孔，導致IgG濃縮率和膜通量降低。因此，綜合考慮超濾壓力對IgG濃縮率和膜通量的影響，確定超濾壓力為0.150 MPa。

圖3 超濾壓力對IgG濃縮率和膜通量的影響Fig.3 Effect of ultrafiltration pressure on IgG concentration rate and membrane flux

2.2.2 料液溫度對截留液IgG濃縮率及膜通量的影響 由圖4可知，隨著超濾系統料液溫度的升高，IgG濃縮率隨之增大，當溫度達到35 ℃時，IgG濃縮率達到最大值為37.6%，隨著溫度的持續升高，IgG濃縮率隨即下降，而膜通量也在35 ℃時達到最高，隨著溫度持續升高，膜通量呈緩慢下降趨勢?？赡苁且驗殡S著溫度的升高，牛初乳乳清粘度降低，提高了料液在膜組件中的流動性，減少污染物在超濾膜表面的吸附，進而使得IgG濃縮率和膜通量增大，當溫度等于或高于35 ℃時，可能是因為膜污染而導致膜通量和IgG濃縮率降低。因此，綜合考慮超濾料液溫度對IgG濃縮率和膜通量的影響，確定超濾料液溫度為35 ℃。

圖4 料液溫度對IgG濃縮率和膜通量的影響Fig.4 Effect of feed liquid temperature on IgG concentration rate and membrane flux

2.2.3 濃縮倍數對截留液IgG濃縮率及膜通量的影響 由圖5可知，隨著濃縮倍數的增加，膜通量呈線性下降，而IgG濃縮率呈先上升后下降的趨勢，當濃縮倍數達到6時，IgG濃縮率達到最大值為42.2%。隨著濃縮倍數的增加，截留液中固形物含量增加，膜表面濃差極化嚴重，部分膜孔堵塞，造成膜污染，從而導致膜通量降低，濃縮倍數低于6倍時，IgG分子被有效截留，當濃縮倍數繼續增大，IgG分子在水力作用下透過超濾膜，進而導致IgG濃縮率降低。因此，綜合考慮超濾濃縮倍數對IgG濃縮率和膜通量的影響，確定濃縮倍數為6倍。

圖5 濃縮倍數對IgG濃縮率和膜通量的影響Fig.5 Effect of concentration times on IgG concentration rate and membrane flux

2.2.4 稀釋次數對截留液IgG濃縮率及膜通量的影響 由圖6可知，隨著稀釋次數的增加，IgG濃縮率和膜通量均呈現先上升后下降的趨勢，當稀釋次數為4次時，IgG濃縮率和膜通量均達到最高，分別為42.59%、179.02 L/m·h，當透過液加水補充至原體積繼續超濾后，透過液中IgG逐漸被濃縮使得濃縮率增大，而稀釋次數越多，料液濃度較低，進而促進了水分子的擴散即膜通量上升。當稀釋次數繼續增大，膜通量和IgG濃縮率降低，這可能是由于隨著透過液稀釋次數的增加，料液中更多的大分子溶質吸附聚集在膜表面，導致傳質阻力變大以及膜的污染現象加重，出現濃差極化現象，進而使得IgG濃縮率和膜通量降低。因此，綜合考慮超濾稀釋次數對IgG濃縮率和膜通量的影響，確定稀釋次數為4次。

圖6 稀釋次數對IgG濃縮率和膜通量的影響Fig.6 Effect of dilution times on IgG concentration rate and membrane flux

2.3 超濾富集IgG的響應面試驗

在單因素實驗基礎上以壓力、濃縮倍數、稀釋次數為自變量，以IgG濃縮率和膜通量為響應值，響應面試驗結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface experiment

2.3.1 響應面回歸模型的建立與方差分析 利用Design-Expert軟件對試驗數據進行多元回歸擬合，得到回歸方程：R=59.23-2.84A+3.13B+2.31C+0.30 AB+3.97AC-2.54BC-8.63A-5.86B-3.68C；

R=201.91+4.32A-2.12B-1.15C+2.69AB+0.66 AC-4.40BC-5.33A-6.73B-7.98C。

方差分析結果見表3、表4。

表3 IgG濃縮率回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of IgG concentration rate regression model

表4 膜通量回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of membrane flux regression model

由表3可知，IgG濃縮率的回歸模型＜0.0001，表明回歸模型高度顯著，失擬項＞0.05，失擬項不顯著，說明該模型具有統計學意義。觀察各因素的值可以得出，因素A、B、C、AC、A、B、C對 IgG濃縮率影響極顯著（＜0.01）；交互項BC對IgG濃縮率影響顯著（＜0.05）；其他變量的影響均不顯著（＞0.05）；說明單因素作用和交互作用對IgG濃縮率均有顯著的影響。此模型的決定系數=0.9788，=0.9516，表明此模型擬合度良好，因此可用該模型來分析和預測微濾-超濾聯用技術富集牛初乳乳清中IgG的工藝條件。

由表4可知，膜通量的回歸模型＜0.0001，說明回歸模型差異極顯著，失擬項＞0.05，失擬項不顯著，說明該模型具有統計學意義。觀察各因素的值可以得出，因素A、BC、A、B、C對膜通量影響極顯著（＜0.01）；交互項 B、AB對膜通量影響顯著（＜0.05）；其他變量的影響均不顯著（＞0.05）；說明單因素作用和交互作用對膜通量均有顯著的影響。此模型的決定系數=0.9759，=0.9450，表明此模型擬合度良好，因此可用該模型來分析和預測微濾-超濾聯用技術富集牛初乳乳清中IgG的工藝條件。

2.3.2 響應面分析 響應面圖形可通過二維空間和三維空間直觀地反映各因素及其交互作用對響應值的影響。由多元回歸方程所作的響應曲面等高線圖和3D圖，如圖7、8所示。

響應面坡度和凹凸程度能夠反映各因素對超濾富集IgG的影響大小，三維響應面坡度陡峭和曲率越大則說明兩個因素的交互作用影響顯著，反之響應曲面的曲線越平坦，則說明兩個因素的交互作用影響較小，等高線為橢圓形表示兩個因素交互作用顯著，等高線為圓形則說明交互作用不顯著。由圖7可知，三個響應曲面陡峭、曲率相對比較大，在因素水平范圍內壓力、濃縮倍數和稀釋次數對IgG濃縮率均有顯著影響，且壓力和稀釋次數的交互作用大于濃縮倍數與稀釋次數和壓力與濃縮倍數的交互作用，試驗結果與方差分析一致。由圖8可知，壓力與濃縮倍數，濃縮倍數與稀釋次數的等高線圖趨于橢圓，響應面圖的曲面較陡，交互作用明顯。壓力與稀釋次數的等高線圖趨于圓形，響應面圖曲面較平緩，交互作用較小。比較3組圖可知，壓力對膜通量的影響最為顯著，曲面較陡。

圖7 不同因素的交互作用對IgG濃縮率影響的響應面圖Fig.7 Response surface map of the interaction of different factors on IgG concentration rate

圖8 不同因素的交互作用對膜通量影響的響應面圖Fig.8 Response surface map of the interaction of different factors on membrane flux

2.3.3 最優配方的驗證試驗 對回歸模型進行響應面分析，得到最佳工藝條件：壓力為0.152 MPa、濃縮倍數為6.04倍、稀釋次數為4.05次，在此條件下，IgG濃縮率為59.24%，膜通量為202 L/m·h?？紤]到實際操作，選用壓力為0.15 MPa、濃縮倍數為6倍、稀釋次數為4次，在此條件下進行三次重復試驗，得平均 IgG濃縮率為 58.19%，膜通量為 204.46 L/m·h，與模型預測結果接近，表明基于該響應面模型分析優化微濾-超濾聯用技術富集牛初乳乳清中IgG工藝條件的方法有效可行。

2.4 理化性質比較

對牛初乳、牛初乳乳清和富集牛初乳乳清中的IgG含量、IgG活性、蛋白含量、脂肪含量以及菌落總數進行測定，如表5所示。

由表5可知，制備初乳乳清使IgG含量損失5.39%，IgG活性損失2.27%，蛋白質含量損失60.98%（主要是酪蛋白），脂肪去除率達到99.04%，菌落總數未發生太大變化。通過微濾-超濾聯用技術使IgG含量提高了58.17%，IgG活性提高了86.74%，蛋白質含量提高了110.72%，脂肪去除率達到14.6%，除菌率達99.9%。

表5 牛初乳乳清富集后品質指標的變化Table 5 Changes of quality indexes after enrichment of bovine colostrum and whey

3 結論

本文探究了牛初乳乳清中IgG富集的基本工藝條件，通過單因素實驗確定微濾除菌的最佳工藝條件：微濾壓力為0.20 MPa、溫度為30 ℃。在單因素實驗的基礎上，通過響應面法建立了多元回歸模型，確定了超濾富集的最優工藝條件：超濾壓力為

0.15 MPa、溫度為35 ℃、濃縮倍數為6倍、稀釋次數為4次。按此條件進行牛初乳乳清的微濾-超濾操作，此時的 IgG濃縮率為 58.19%，膜通量為

204.46 L/m·h，并對富集后的牛初乳乳清進行了品質分析：IgG含量為22760 μg/mL，IgG活性為718.31 IU/L，蛋白質含量為7.86%，脂肪含量為0.035%，菌落總數為2.4 lg CFU/mL。由于整個工藝在溫度較低的條件下進行，牛初乳中的熱敏性成分（IgG）損失較少，提高了產品的質量，為牛初乳乳清中IgG的進一步開發與綜合利用提供了一定的參考依據。但作為功能性食品要大規模開發必需解決以下基本問題。一是缺乏相應的國家標準，目前只有行業規范；二是國家缺乏對牛初乳產品的監管機制及監管辦法。