高壓二氧化碳在肉品殺菌保鮮中的應用研究進展

牛力源，張藝林，劉靜飛，吳梓浩，張志堅

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450001；2.河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，河南鄭州 450001）

肉及肉制品營養價值高，不僅能夠提供相對豐富易吸收的鐵元素，還是人類優質蛋白質和維生素B（包括植物性食品中缺乏的維生素B）的主要來源。然而，肉品在屠宰、冷凍、切割、加工、儲存等過程中容易受到各種微生物的污染，導致肉質腐敗，甚至引發食源性疾病。2009～2015年間美國食源性疾病爆發監測系統（FDOSS）報告了5760起食源性疾病，其中，導致疫情相關疾病最多的食品類別是雞肉（12%）和豬肉（10%）。2017年歐洲共報告了5228起食源性疫情，沙門氏菌是所有食源性病原體中檢測到的最常見病原體，主要與肉類、肉制品、蛋類和蛋制品有關。由此可見，在消費食品中占很大比例的肉及肉制品，其質量安全仍然是一個關鍵的公共衛生問題。

為了確保肉品的質量和安全，必須采用適當的肉品保鮮技術。目前用于肉類保鮮的傳統方法主要包括添加化學防腐劑、冷凍、真空包裝和蒸汽殺菌等。然而，隨著人們對食品營養品質要求的不斷提升，諸如超高壓、超聲波、冷等離子體等新型非熱殺菌技術在食品加工保鮮領域的應用正受到世界范圍的廣泛關注。與傳統熱殺菌相比，非熱殺菌技術能耗較低，在保障食品安全的同時，也能較好的保存加工原料的固有營養成分和新鮮度等，使得殺菌過程導致的品質劣變降到最低。

高壓二氧化碳（High pressure carbon dioxide,HPCD）是一種新型非熱殺菌技術，其在果蔬、肉品、谷物、液體食品等加工、貯藏與保鮮中的應用研究廣泛。該技術將二氧化碳（CO）與壓力相結合，使用間歇、半間歇或連續處理設備，在相對溫和的溫度（＜60 °C）和壓力（＜50 MPa）條件下進行處理，形成高壓、酸性環境，在達到顯著殺菌和鈍酶效果的同時，最大限度保持食品原有的營養、色澤、質構與風味，在食品微生物控制領域中具有潛在的應用前景。CO的抑菌作用首次在1927年發現，其抑菌作用與CO的濃度呈正相關。1951年Fraser研究高壓氣體減壓破裂細菌時發現，相比于高壓氮氣和高壓一氧化二氮，壓力狀態下的CO具有更加顯著的殺菌效果。在20世紀80年代末期，一批日本學者展開了使用高壓氣體作為熱殺菌替代方法的相關研究。經研究發現，在相同條件下，加壓CO的殺菌效果要優于其它氣體介質。此外，CO具有化學惰性、無腐蝕性、高揮發性、不可燃、無毒、無味等優點，且價格低廉、易取得。因此，HPCD技術受到了食品加工領域研究學者的廣泛關注。

本文綜述了近年來單一HPCD處理及其與其它方法協同作用對肉品中微生物的殺滅效果、肉品理化品質、質構特性和微生物穩定性的影響研究，以期為HPCD技術在肉品殺菌保鮮中的應用提供理論支持。

1 HPCD殺菌機制研究

1.1 HPCD使微生物營養體失活的機制

基于CO的物理和化學性質，國內外關于HPCD殺菌機制的推測主要為細胞機械性破裂和生理性失活兩種觀點。在關于HPCD技術的早期研究中，微生物細胞被認為是在快速減壓作用下破裂的。由于加壓后CO進入微生物細胞內部導致細胞內外不平衡的壓力差，細胞可能在瞬間減壓時發生機械性破裂。但是，也有研究表明增加減壓速率并不能促進微生物細胞的失活，大多數細胞似乎在加壓階段就已經被滅活，因為部分微生物在HPCD處理后完全失活而細胞仍然完整。雖然機械性破裂可能是某些細胞死亡的原因之一，但HPCD技術的致死效應主要還是與其它生理機制有關（圖1）：a.CO與細胞質膜或細胞器膜間的高親和力可造成膜的結構和功能變化，使生物膜的滲透性和流動性增加；b.CO的擴散性和溶解性有助于CO與水分子反應解離出H，降低細胞內外pH，破壞細胞質pH穩態和膜電位動態平衡；c.HPCD處理使蛋白質從純水相遷移至CO/水界面，蛋白質核心疏水區域釋放至CO相，表面親水基團殘基移至水相，蛋白質構象發生改變，導致部分酶活性下降甚至完全失活；d.CO分子及（或）其解離出的HCO和CO可能使細胞膜及細胞內無機電解質發生沉淀，導致細胞膜結構破壞及細胞內電解質平衡紊亂；e.CO、HCO、CO作為反應物或產物的細胞代謝活動可能會受到促進或抑制，如尿素循環代謝等。盡管國內外研究學者對于HPCD技術的殺菌機制已有一定理解，但目前仍未完全闡明，HPCD脅迫下影響微生物活性的關鍵代謝環節仍需進一步研究。

圖1 HPCD失活微生物營養體的機制示意圖Fig.1 The schematic diagram of inactivation mechanism of HPCD against microbial vegetative cells

1.2 HPCD使微生物芽孢失活的機制

目前關于HPCD失活微生物芽孢的機制主要有兩種假說。一種是微生物芽孢首先被激活、萌發，然后在HPCD處理下失活。凝結芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌芽孢經HPCD和90 °C高熱依次處理后完全失活，Watanabe等分析這可能是由于HPCD處理降低了細菌芽孢的耐熱性，因此，HPCD的萌發作用被認為是其導致芽孢失活的主要原因之一。然而，Rao等通過對失活枯草芽孢桿菌芽孢的形態觀察以及分子生物學分析發現，HPCD處理并未誘導芽孢萌發，而是增加了芽孢內膜和皮層的通透性，破壞了芽孢結構，導致核心物質如吡啶二羧酸（DPA）和金屬離子等的釋放，最終提高了芽孢的熱敏性，這是HPCD失活細菌芽孢的另一種假設機制。另外，芽孢失活也可能與CO溶解于水溶液導致芽孢內部pH降低或某些酶失活有關。雖然近期研究結果似乎更支持“結構破壞導致芽孢失活”這一假設機制，但HPCD究竟如何作用于芽孢并破壞其內膜仍未十分清楚，HPCD對芽孢內膜特性的影響還需要進一步研究。

2 HPCD處理肉品的殺菌效果研究進展

2.1 單一HPCD處理肉品的殺菌效果研究

單一HPCD技術應用于肉品微生物安全控制的相關研究見表1。多項研究表明，HPCD處理能夠有效降低生肉中的致病菌和致腐菌。生豬肉中的嗜溫菌在 25～40 °C 下經 6～16 MPa HPCD 處理 5～60 min后大約減少了1.0～3.0 lg CFU/cm，殺菌效果隨溫度升高和處理時間的延長而增強。HPCD處理對冷卻豬肉中的大腸桿菌、假單胞桿菌以及細菌總數也同樣具有顯著的殺滅效果，而且殺菌速率隨時間呈現由快到慢的動力學曲線。相反，HPCD對牛肉糜中的熱殺索絲菌的滅活效率隨著處理時間的增加呈現“先慢后快”的動力學現象，這可能與革蘭氏陽性菌對HPCD的抗性更強有關。Jauhar等報道了在45 °C下，經14 MPa HPCD處理40 min后，雞肉中總菌數、酵母菌和霉菌數分別減少了2.27、3.07 lg CFU/g。此外，HPCD技術還被應用于腌漬肉、香腸等多種肉類制品的殺菌保鮮研究中。在60 °C下經20 MPa HPCD處理30 min后，生羊肉香腸中需氧菌、腸桿菌、乳酸菌和微球菌的數量分別顯著減少了2.52、＞5.72、＞4.09和 2.09 lg CFU/g。使用 HPCD 技術處理生鮮調理雞肉和腌漬豬肉，對細菌的滅活效果同樣顯著。Schultze等將HPCD作為熱殺菌的替代技術對牛肉干進行殺菌處理，結果發現濕潤的CO氣體（被水飽和的氣態 CO，5.7 MPa、65 °C）使接種在牛肉干表面的干燥大腸桿菌和沙門氏菌顯著減少超過5.0 lg CFU/g，而且還證實了對于低水分活度食品上的革蘭氏陽性菌和陰性菌，氣態CO的殺菌效果比超臨界狀態CO更為有效。

表1 單一HPCD處理對肉品的殺菌效果研究Table 1 Studies on the antimicrobial effect of HPCD alone treatment on meat and meat products

盡管HPCD技術能夠有效滅活各種微生物營養體（＜30 MPa，20～40 °C），但很難在溫和條件下（20～40 °C）滅活細菌芽孢。因此，多數研究將HPCD技術與其他處理方法相結合，以增強對芽孢的滅活效果。Karajanagi等將HPCD的處理溫度提高到75 °C，枯草芽孢桿菌芽孢減少了7 lg CFU/mL。Gomez-Gomez等將HPCD與高場強超聲波技術（high power ultrasound，HPU）結合處理顯著提高了HPCD對丁酸梭狀芽胞桿菌芽孢的滅活效果，但對黑曲霉孢子則沒有展現出協同作用。HPCD聯合乙醇、乙酸、過氧化氫等化合物處理也可提高其對芽孢的滅活效果。李鳳娟等應用HPCD技術滅活取自豬肉糜的枯草芽孢桿菌芽孢，發現在各處理參數中，CO壓力對HPCD失活芽孢效果的影響最大，其次是保壓時間。此外，在添加殺菌劑和萌發誘導劑后，枯草芽孢桿菌芽孢對HPCD處理的抗性明顯降低。然而，目前關于HPCD技術直接失活食品體系中食源性細菌芽孢的研究還很有限。

2.2 HPCD聯合其它非熱技術對肉品的殺菌效果研究

為了提高殺菌效率，多項研究將HPCD與其它加工方法相結合對肉品進行加工處理（表2）。Spilimbergo 等應用 HPCD（12 MPa）聯合 HPU（10 W）對接種有單增李斯特菌的干熏火腿殺菌處理5 min后，發現在22 °C下二者沒有展現出協同效應，但當處理溫度升至35 °C時，HPCD協同HPU的殺菌效果比單一HPCD處理更為有效。HPCD技術聯合HPU在45 °C下處理熟火腿后，嗜溫菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌數量也顯著下降，而單一HPCD處理若要達到對熟火腿中嗜溫菌和乳酸菌相同的滅活效率，則需要延長處理時間。這可能是由于在該溫度下細胞膜的流動性增加，而且加壓CO此時為超臨界流體狀態，具有高擴散率和強溶劑能力，能夠更快地穿透細胞膜，并容易從細胞質中提取出細胞成分。Morbiato等還報道了HPCD與HPU聯合干燥生雞胸肉，不僅出水速度快、復水能力高，還能有效殺滅生雞胸肉表面接種的沙門氏菌。在HPCD與HPU的聯合處理中，CO作為一種高密度流體傳輸超聲波，在其加壓系統中，超聲會誘導微攪拌和溶劑空化，導致微生物細胞壁膜破損；同時，超聲波能夠促進溶劑擴散，引起界面湍流，從而降低CO傳質的外部阻力，因此，二者結合處理會展現出良好的協同殺菌效果。Castillo-Zamudio等還發現，將HPCD+HPU（42 W）與生理鹽水（0.85% NaCl）結合使用可以明顯提高HPCD+HPU對干熏火腿中大腸桿菌的殺菌效率，這可能是由于生理鹽水的加入引發了更強的空化效應。HPU單獨應用時殺菌效果雖然顯著，但在高強度超聲下大量能量會以熱能形式耗散，造成浪費，同時也會縮短儀器的使用壽命。將HPCD與HPU結合應用于肉品的生產加工，在有效提升殺菌效率的同時，還可以降低能耗和資金投入。此外，HPCD結合肉品添加物也具有良好的協同殺菌效果。HPCD（12 MPa）聯合 3% 有機酸（乳酸或醋酸）在 35 °C 下處理生鮮豬肉30 min后，大腸桿菌、單增李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌O157:H7的失活率比單一HPCD或有機酸處理更高。González-Alonso等發現HPCD結合純芫荽精油（0.5% v/w）處理雞肉表面大腸桿菌也顯示出了良好的協同殺菌效果。

表2 HPCD聯合其它非熱技術對肉品的殺菌效果Table 2 Antimicrobial effect of HPCD combined with other non-thermal technology on meat and meat products

微生物的生長是決定肉品貨架期長短的主要因素之一。尤其是低溫肉制品，其熱加工溫度低，殺菌不徹底，加之肉品本身水分活度高、營養成分多、pH高，操作不當污染后很容易引起微生物的生長和繁殖，導致肉品腐敗變質。單一HPCD處理肉品時需要較高的CO壓力、較長的處理時間或較高的處理溫度來提升其殺菌效果，這不僅會增加對設備的資金投入，降低加工效率，還可能會影響食品品質。上述研究發現，將HPCD技術與HPU、有機酸、精油等方法相結合對各類肉及肉制品進行殺菌處理，不僅展現出了顯著的協同增效效應，還規避了各殺菌方法單獨應用時的弊端。由此可見，在肉品加工領域中HPCD技術與其它抗菌方法累加或交互應用的綜合殺菌保鮮技術可能比單一HPCD技術更具前景。

3 HPCD處理對肉品品質及微生物穩定性的影響

雖然HPCD技術能夠有效殺滅各類肉及肉制品中的微生物，但由于CO對固體食品的穿透能力較弱，需要較長的處理時間和較高的處理溫度才能獲得微生物安全的肉類食品，這可能會對食品的品質特性產生不良影響。HPCD技術及其聯合其它方法處理對肉品品質特性的影響見表3。

表3 單一HPCD或聯合其它非熱技術對肉品品質特性的影響Table 3 Effects of treatment with HPCD alone or combined with other non-thermal technology on the quality attributes of meat and meat products

3.1 HPCD處理對肉品理化特性的影響

3.1.1 硫代巴比妥酸反應物（TBARS） 脂質氧化與食品品質劣變有關，是肉品氧化變質的主要原因。TBARS值是評價脂質氧化程度的常用指標，肉品中TBARS值超過2.0 mg/kg可能會產生不良風味。劉芳坊等在常溫下對冷卻豬肉進行HPCD處理的研究中發現，短時間處理對防止肉品氧化并沒有效果，隨著處理時間的增加，TBARS值有所上升；但當處理時間超過30 min后，TBARS值反而下降，這可能是由于脂肪氧化酶在HPCD長時間作用下活性受到抑制所致。此外，在貯藏期間，經HPCD處理肉品的TBARS值會隨著貯藏時間的延長而增加。其中，經HPCD處理的豬肉糜在貯藏3 d后，TBARS值比未處理組高出27%，HPCD處理對豬肉糜似乎具有助氧化的作用。當HPCD與2.5%或5%迷迭香粉末聯合應用時，與單一HPCD處理組相比，TBARS值則分別顯著降低了8.2%和9.8%，肉品氧化程度得到緩解，但仍高于未處理組。

3.1.2 揮發性鹽基氮（TVB-N） TVB-N值是衡量肉品新鮮程度的重要參考指標之一，反映肉中微生物的繁殖狀況和蛋白質的分解情況。閆文杰等研究報道了隨著貯藏時間的延長，經HPCD處理的冷卻豬肉的TVB-N值的增加與未處理樣品相比相對緩慢，貯藏10 d后，未處理樣品的TVB-N值升高至14.93 mg/100 g，經21 MPa HPCD處理的樣品TVB-N值則僅升高至7.04 mg/100 g，表明HPCD處理可延緩冷卻豬肉的腐敗變質，這與HPCD處理減少了貯藏肉品的初始菌數有關。經 HPCD（18 MPa，30 °C，30 min）處理的預包裝紅燒肉在4 °C下貯藏期間（90 d）TVB-N值也隨著時間的延長而增加，但低于高溫處理（121 °C，30 min）的紅燒肉的 TVB-N 值，這可能是高溫處理導致紅燒肉中的蛋白質分解所致。在貯藏研究中，HPCD聯合迷迭香粉末處理的豬肉糜的TVB-N值在7 d的貯藏過程中逐漸升高，但仍顯著低于未處理組，各處理組間無顯著差異。在貯藏7 d后，單獨HPCD處理組的TVB-N值較HPCD聯合5%迷迭香粉末處理組高出2.27 mg/100 g，協同處理的肉品TVB-N值增加速度較慢，表現出了更好的保鮮效果。

3.1.3 pH pH是決定肉品品質如保水能力、嫩度、顏色、風味和貨架期等的關鍵因素。研究表明，在7.0～15.2 MPa下HPCD處理的生豬肉和生雞肉的pH變化不大。然而當壓力升至21 MPa時，冷卻豬肉的pH則顯著降低，可能是由于在高壓條件下，CO更容易擴散進入肉中，形成碳酸，使肉的pH降低。相反地，在35 °C下經13.79 MPa的HPCD處理2 h后，豬肉糜的pH相比于未處理組顯著升高了0.15，作者認為這可能是在加壓處理期間蛋白質的展開掩蓋了氨基酸的酸性基團所致；而在冷藏5 d后豬肉糜的pH卻顯著低于未處理樣品，可能與貯藏過程中需氧菌的繁殖有關。此外，HPCD結合HPU對干熏火腿表面的酸度和pH也沒有顯著影響。但是，HPCD處理溫度和時間對羊肉香腸的pH有顯著的交互作用，羊肉香腸的pH會隨著HPCD處理時間（15～60 min）或處理溫度（50～60 °C）的增加而增加。這與生豬肉的研究結果不一致，可能是由于處理溫度不同，肉類蛋白在加熱過程中的熱變性會使其pH增加。

3.1.4 保水性 肉的保水性是衡量肉品品質和經濟價值的重要指標之一。肉品的保水性與CO壓力、處理時間和處理溫度有關。Choi等發現豬背最長肌在 31.1 °C 下經 HPCD（7.4～15.2 MPa）處理10 min對其保水性并沒有影響，相似條件下HPCD處理也沒有影響雞肉的保水性。在恒溫下CO壓力從10 MPa升至30 MPa也不會增加牛肉糜的水分流失，但將溫度從35 °C提升至50 °C后，水分流失則明顯增加（16.5～23.0 g），這表明溫度對肉品保水性的影響比CO壓力更重要。相反地，Szerman等發現，恒溫下HPCD壓力的增加（10～30 MPa）和處理時間的延長（2～25 min）均增加了羊肉香腸的重量損失和汁液損失。在55 °C、10 MPa下，將處理時間由2 min延長至25 min后，羊肉香腸的汁液損失顯著增加了4.36%。不同HPCD處理參數對肉品保水性的影響似乎與肉品種類有關。此外，HPCD處理對貯藏期雞肉和豬肉的保水性沒有顯著影響。

3.2 HPCD處理對肉品色澤的影響

HPCD和傳統蒸煮技術一樣，會顯著改變生肉產品的色澤，使肉品外觀接近于“熟肉”。冷卻豬肉經HPCD處理后，一般會出現值（亮度值）顯著增加，值（紅度值）顯著下降，肉品呈現灰白色。這可能是由于CO壓力使肉中血紅素釋放，導致肌紅蛋白和血紅蛋白二級結構發生改變而變性，同時高壓也可能會對還原（高鐵肌紅蛋白）或氧化（氧合肌紅蛋白）肉品肌紅蛋白的酶類產生影響，從而影響肉色的亮度和紅度。這與HPCD處理生雞肉和羊肉香腸的色澤結果相一致。另有研究發現，HPCD與高強度HPU（42 W）聯合處理干熏火腿不會改變樣品的亮度，但會增加其紅度和黃度，而與較低強度（10 W）HPU結合使用則不會對火腿制品各色澤參數產生明顯影響。

3.3 HPCD處理對肉品質構特性的影響

質構也是肉品的重要品質特性之一。在低于60 °C條件下，生雞肉和香腸經HPCD處理后，各質構參數如硬度、彈性、膠著性等會顯著增加。這可能由于高壓導致肉品的緊實度增加，硬度趨于較高，所以肉質更接近于熟肉。同時，香腸的各質構參數值還會隨HPCD處理時間的延長而增加，但當處理溫度升至60 °C時，其彈性和粘結性不再受處理時間的影響。將HPCD與HPU結合處理火腿樣品，不會改變火腿的硬度，并且在貯藏期間也不會發生顯著變化，而未經處理的熟制火腿的硬度在貨架期間則顯著下降。HPU的超聲強度（在10～1000 W/cm）是影響食品粘度和質地的一個重要因素，肉制品長時間暴露在高強度超聲波（＞100 W/cm）下，會改變肌原纖維蛋白的構象，促使其由大分子聚合物解離為小分子蛋白，從而使肉質嫩化。Castillo-Zamudio等發現，高強度的HPU（42 W）與HPCD聯合使用甚至會使干熏火腿軟化。因此，HPCD與HPU的聯合應用有助于維持甚至改善肉品的質構特性，延長肉品貨架期。

綜上所述，單一HPCD技術對肉及肉制品品質特性的影響取決于加工處理各參數如溫度、時間、CO壓力以及肉品的種類。高強度的HPCD處理雖然可以有效控制肉品中的微生物，但對肉品的理化品質和質構特性等會產生較大的不利影響。將HPCD技術與其它方法聯用，可能有助于維持肉品品質。然而，針對不同的肉類產品，哪種協同方法更為適用，還需進行全面、深入的探索。

3.4 HPCD處理對貯藏期肉品微生物穩定性的影響

一般來說，貨架期的結束取決于貯藏期間微生物的增殖情況，因此，研究HPCD處理肉品的微生物穩定性對食品安全也十分重要。HPCD處理（18 MPa，30 °C，30 min）的預包裝紅燒肉在貯藏第 90 d時菌落總數仍遠遠小于《GB 2726-2005熟肉制品衛生標準》中的要求（8×10CFU/g）。經 HPCD 處理（45 °C，14 MPa，40 min）的生鮮雞肉中總菌數和酵母菌和霉菌數在低溫貯藏期間逐漸減少，貯藏7 d后與未處理組相比分別減少了3.9和3.0 lg CFU/mL。Huang等同樣報道了HPCD處理能夠有效延緩冷藏豬肉糜中微生物的生長，聯合5%迷迭香（w/w）處理的保鮮效果更優。此外，經HPCD和HPU聯合處理（12 MPa, 45 ℃，15 min，10 W，間歇 2 min 或 25 MPa，46 °C，10 min，42±5 W）后貯藏在 4 °C 下的火腿制品其微生物穩定性也可以維持至少20 d。Spilimbergo 等也報道了干熏火腿經 HPCD（12 MPa，35 °C，5 min）聯合 HPU（10 W，間歇 2 min）處理后，在 4周的冷藏期內都沒有檢測到單增李斯特菌。由此可見，雖然單一HPCD技術可以有效維持貯藏期間肉品的微生物穩定性，但將其與其它技術結合使用的殺菌保鮮效果更優。

4 結語與展望

HPCD技術作為一種新型的非熱殺菌技術，在減少肉品中微生物數量、提高肉品安全性方面具有較大的應用潛力。然而，高壓、高溫以及長時間處理，會對肉品分子的相互作用和蛋白質構象產生影響，導致肉品顏色和結構變化。多項研究表明，將HPCD技術與其它非熱處理（HPU、有機酸、植物精油等）聯合應用，可以彌補其不足，在顯著提高殺菌效率的同時，還可以最大限度地維持食品的原有品質，應用前景廣闊。但是，目前關于HPCD聯合技術在肉品加工中的應用研究有限，且主要集中于對殺菌效應和品質的影響研究，對聯合殺菌機制的研究并不深入，各類肉品基質對聯合殺菌效果的影響也未明確，最優處理參數還需探索。為了推動HPCD及其聯合技術在肉品加工工業中的應用，今后的研究工作建議從以下幾個方面展開：a.研究聯合技術的協同殺菌機制，結合轉錄組學、代謝組學等多種組學技術從分子水平進行整合分析，同時進行生物學驗證；b.研究探索適用于失活肉品中微生物芽孢的HPCD聯合技術；c.研究肉品基質對各聯合技術的干擾效應，開展聯合殺菌在各類肉品中的應用實驗，篩選所適用的肉品類型；d.建立各聯合處理下適用于肉品中微生物的失活動力學模型，明確聯合處理對肉品品質特性的影響規律，優化工藝參數；e.評估各聯合技術最適用肉品的貨架期和長期安全性，為推進HPCD技術在肉品工業中的應用提供理論依據。