一株新分離的嗜熱藍藻及其藻藍蛋白的穩定性研究

岳 瑤，郭桂筱，李雁群,3, ，胡雪瓊

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088；2.廣東海洋大學海洋藥物研究所，廣東湛江 524088；3.廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東湛江 524088）

藍藻（Cyanobacteria），又名藍細菌、藍綠藻，是一種形態簡單的產氧光合原核微生物，是重要的初級生產者，是地球上最原始的生命形式之一，距今已有超過30億年的生活歷史。藍藻分布范圍廣、適應性強、生長快速，幾乎棲息在所有環境中，甚至包括各種極端環境，如高溫溫泉、寒冷冰川、堿性湖泊、干旱沙漠等。藍藻應用于食品領域已有很長的歷史，其包含多種生物活性成分，如天然色素、蛋白質、脂肪酸、多糖、維生素、微量元素等，具有極高的營養價值；部分藍藻還因能產生具有抗菌、抗病毒和抗癌活性的次生代謝產物而被廣泛應用于藥物開發。藍藻是一大門類的微藻，有大量的藻種具有各種優良特性，但絕大多數藍藻尚未被開發研究。嗜熱藍藻是一類能在50 ℃以上生長的高溫藻，在食品領域的研究很少，由于其具有高溫適應性，其細胞內生物活性成分往往可能具有某些特殊性質。

藻藍蛋白是藻膽蛋白家族的一員。藻膽蛋白是存在于藍藻、紅藻及隱藻等藻類中的色素蛋白，是光合作用的捕光天線。藻膽蛋白有三種類型，即藻紅蛋白（phycoerythrin, PE）、藻藍蛋白（phycocyanin,PC）和別藻藍蛋白（allophycocyanin, APC）。藻藍蛋白是天然的藍色素，其吸收波長范圍為610～630 nm，主要存在于藍藻中，由脫輔基蛋白和開鏈四吡咯發色團組成。藻藍蛋白是我國批準的可以食用天然藍色色素，目前主要用作著色劑添加在食品及化妝品行業，同時還具有一定的抗氧化、抗腫瘤和增強免疫力等功能。藻藍蛋白在食品加工領域具有廣闊的應用前景，但由于目前市場上的藻藍蛋白熱穩定性差，即使在巴氏殺菌條件下，藻藍蛋白也不能耐受，因此現在主要應用于冷飲或冷制食品中。除此以外，藻藍蛋白對光照強度及酸堿環境也非常敏感，限制了其在食品領域更廣泛的應用。為了提高藻藍蛋白的穩定性及拓寬其在食品加工領域的使用范圍，有人通過使用添加劑（糖、檸檬酸、氯化鈉、乳清蛋白等）來延長藻藍蛋白的半衰期；有人通過對蛋白質構象進行修飾以保持蛋白質的高級結構穩定從而達到穩定色素的目的；也有人通過將藻藍蛋白微膠囊化，通過包衣保護的方式來提高穩定性，這些方法雖然能取得一定的效果，但改善作用有限，不足以滿足食品加工的要求。因此，若能找到一種不會在嚴苛的食品加工環境中褪色的藻藍蛋白，那么將具有非常廣闊的潛在市場。

目前，國內外對藻藍蛋白的研究主要集中在中溫藻，關于利用高溫藻提取藻藍蛋白的研究較少，高溫藻由于生長環境特殊，其藻藍蛋白可能具有某些獨特的性質。本文從湖南一處高溫溫泉采集的樣品中分離純化得到一株嗜熱微藻，初步試驗表明其生長溫度范圍為40～65 ℃，具有很好的高溫適應性。本研究擬采用形態學觀察和分子生物學分類研究的方法，確定所分離藻株的生物學分類地位。通過提取該藻的藻藍蛋白，研究其溫度、光照及酸堿穩定性，為該藻的潛在應用提供研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藻株來源 2019年8月，從湖南一處溫泉中采集了藻液樣本，采樣時水溫為70 ℃，采樣地點位于東經 11354′59.05′、北緯 2532′6.86′；BG11 培養基：NaNO1.5 g/L， KHPO0.04 g/L， MgSO·7HO 0.075 g/L，CaCl·2HO 0.036 g/L，檸檬酸 0.006 g/L，檸檬酸鐵銨0.006 g/L，乙二胺四乙酸二鈉0.001 g/L，NaCO0.02 g/L，HBO2.86×10g/L，MnCl·4HO 1.81×10g/L，ZnSO·7HO 0.22×10g/L，NaMoO·2HO 0.39×10g/L， CuSO·5HO 0.79×10g/L，Co（NO）·6HO 0.49×10g/L；2×Taq Master Mix、DL2000 DNA marker、6×Loading buffer、植物 DNA提取試劑盒 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；瓊脂糖、50×TAE緩沖液 生工生物工程（上海）股份有限公司；Gold View Ⅰ型核酸染色劑 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司；

HZQ-F280恒溫搖床培養箱 江蘇省金壇市萬花實驗儀器廠；DV320光學顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限責任公司；752紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；X-30R 高速冷凍離心機貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司；SC300梯度PCR儀 上海啟前科技有限公司；DYY-8C型電泳儀北京市六一儀器廠；EVOS XL Co凝膠成像儀 廣州譽為生物科技有限公司；Scientz-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藻種的分離純化 先將從溫泉采集的水樣用濾紙過濾掉雜質，再將其接種至BG11培養基中，置于溫度50 ℃，光照強度4000 lux，轉速150 r/min，光照周期12 h：12 h的培養箱中培養。培養液逐漸變成藍綠色即富集培養完成，取少量樣品采用稀釋涂布平板法接種于加入瓊脂的BG11固體培養基上，培養7 d后，挑取綠色的單藻落，再采用劃線分離法接種于新鮮固體培養基上，待藻落長出，挑取長勢優良的單藻落接種于96孔板，然后逐步擴大培養，按10%的接種量進行接種，全過程均在50 ℃條件下培養，直至最終完成藻種的分離純化。

1.2.2 分離藻株的形態觀察 取對數生長期的藻液50 μL，置于光學顯微鏡下觀察，并拍照記錄。根據《中國淡水藻類——系統、分類及生態》進行初步分類鑒定。

1.2.3 DNA提取、PCR擴增及測序 取適量對數生長期的藻液，3500 r/min離心5 min，棄上清，用液氮將藻泥凍結后研磨成藻粉，采用植物DNA提取試劑盒提取微藻DNA，具體步驟按試劑盒說明書進行。

以提取的微藻DNA為模板，PCR擴增16S rRNA基因 DNA 序列片段，引物序列為：27f（5’-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3’），1492r（5’-GGTTACCTTGT TACGACTT-3’）， PCR 反應體系為：模板 2.5 μL、引物 1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，用 ddHO將體系補至25 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預變性4 min、94 ℃ 變性 30 s、55 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸30 s，30 個循環，72 ℃ 再延伸 10 min。

擴增完成后，擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠，100 V電泳25 min，電泳完成后，將其置于凝膠成像儀中觀察結果。PCR擴增產物送至上海生工生物公司進行測序。

1.2.4 系統發育樹的構建 測序完成后，用DNAMAN 8.0軟件將測序結果進行序列拼接，并于NCBI網站上（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行 Blast同源性比對分析，選取同源序列，使用MEGA7.0軟件進行序列比對分析，并采用M-L法構建系統發育樹，bootstrap值1000次重復計算以評估分支可信度。

1.2.5 藻粉的制備 取1.2.1中分離的藻種，按10%接種量接種至BG11培養基，以0.4 L/min的恒定流量連續通氣并攪拌培養物，在50 ℃、通入含15% CO的空氣、4000 lux光照條件下培養，在指數生長期結束時（第5 d）收集藻液，4500 r/min離心5 min，收集藻體，用去離子水洗去殘留的鹽分，經冷凍干燥48 h后獲得藻粉。

1.2.6 藻藍蛋白的提取 稱取0.1 g藻粉于50 mL離心管，加入10 mL水，浸泡2 h，使用超聲破碎儀在冰水浴中破碎細胞，超聲功率550 W，超聲2 s，間隔3 s，總時間15 min，超聲完畢后，藻液在8000 r/min離心10 min（4 ℃），收集上清液即為藻藍蛋白粗提液。整個實驗過程保持樣品避光。

1.2.7 藻藍蛋白色價 將上述藻藍蛋白粗提液經冷凍干燥獲得藻藍蛋白粉。準確稱取0.025 g藻藍蛋白粉，用磷酸鹽緩沖液（pH6.8）溶解并定容至10 mL，稀釋10倍后，測定620 nm的吸光值。將測定結果帶入式（1），計算色價值：

1.2.8 藻藍蛋白穩定性試驗

1.2.8.1 溫度穩定性試驗 取上述1.2.6中提取得到的藻藍蛋白粗提液（濃度為1.137 mg/mL），分別置于4、30、40、50、60、70、80 ℃ 下，避光放置，每隔 0.5 h取樣，每組3個平行，測定其在620 nm下的吸光度。

1.2.8.2 光照穩定性試驗 取上述1.2.6中提取得到的藻藍蛋白粗提液（濃度為1.137 mg/mL），分別置于 1000、2000、3000、4000、5000和 6000 lux的光照強度下，室溫放置，每隔1 d取樣，每組3個平行，測定其在620 nm下的吸光度。

1.2.8.3 酸堿穩定性試驗 用0.01 mol/L的HCl和0.01 mol/L的NaOH溶液調節藻藍蛋白粗提液的pH，調節 pH 為 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，在 4 ℃避光放置，每隔0.5 h取樣，每組3個平行，測定其在620 nm下的吸光度。

1.2.9 藻藍蛋白分析方法 在280、620、650 nm處測定粗提液的吸光值（A），由式（2）～（4）分別計算藻藍蛋白純度（P）、濃度（C）和得率（Q）。

式中：P為藻藍蛋白純度；C為藻藍蛋白濃度，mg/mL；Q為藻藍蛋白得率，%；K為樣品稀釋倍數；V為提取液總體積，mL；m為原料質量，mg。

1.3 數據處理

每組實驗重復三次，采用SPSS 23.0和Excel 2010對數據進行分析處理，實驗數據以平均值和標準差表示。采用GraphPad Prism 8.0.2 和Origin 2018進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 分離藻株的形態觀察

本研究室將從湖南高溫溫泉采集樣品中分離得到的微藻進行純培養，建立起株系，將其命名為HN-54。經光學顯微鏡觀察，藻細胞為細長桿狀的單細胞，直或有時彎曲，細胞繁殖的方式為二分裂，如圖1所示。

圖1 光學顯微鏡圖Fig.1 Optical micrographs

2.2 PCR擴增

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，經PCR擴增出的16S rRNA基因目的片段是單一條帶，片段大小在1500 bp左右，結果如圖2。

圖2 微藻的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA of the alga

2.3 系統發育樹的構建

采用雙向測序的方法得到的序列長度為1395 bp，完整序列在NCBI網站上經Blast同源性比對，再使用MEGA7.0軟件構建系統發育樹，結果如圖3所示。

圖3 基于16S rDNA序列構建系統發育樹Fig.3 The phylogenetic tree constructed based on the 16S rDNA sequence

系統發育樹顯示其與WFW（KC621876.1）、BP-1（MF191714.1）、NIES-2134（MF191712.1）同源性最高，該分離藻株與藍藻門中的嗜熱聚球藻屬最為接近，結合形態學觀察結果分析，應將其定為嗜熱聚球藻屬的一支，將其命名為sp.HN-54（NCBI登錄號：ON212490）。由于 16S rRNA 基因在整個遺傳進化過程中相對保守，不足以提供關于不同藻株之間關系的充足信息，無法鑒定至種水平，因此種一級的分類學地位鑒定尚需要依賴于進一步的研究結果。

2.4 藻藍蛋白的提取得率和純度

在超聲輔助條件下從HN-54中得到的色素粗提物中藻藍蛋白純度為0.941，得率為11.37%，相較于行業標準螺旋藻藻藍蛋白的含量10%～20%而言，HN-54藻藍蛋白含量較高，可以作為提取藻藍蛋白的來源。

2.5 藻藍蛋白色價

經計算，藻藍蛋白的色價為196.53，與賓美生物科技有限公司中產品藻藍蛋白E18的企業標準（E618 nm≥180）相比，達到其色值指標，說明本研究的藻藍蛋白可以達到目前市場上同類產品的色值標準。

2.6 藻藍蛋白穩定性試驗

2.6.1 熱穩定性試驗 環境溫度對藻藍蛋白穩定性的影響如圖4所示。以藻藍蛋白溶液在620 nm處的吸光值為指標來表達色值的高低，通過A的變化來反應藻藍蛋白的穩定性，從圖4的結果可見HN-54的藻藍蛋白在60 ℃以內的溫度條件下非常穩定，吸光值隨著時間的延長基本保持不變。但在70和80 ℃時，藻藍蛋白的吸光值隨著時間的延長不斷下降，2 h后逐漸趨于穩定。溫度越高，色值下降越迅速，當溫度為70 ℃時吸光度下降了26.7%；而在80 ℃時吸光度下降了75.4%。歐瑜等研究發現，鈍頂螺旋藻藻藍蛋白在溫度升高到50 ℃時穩定性就會降低，60 ℃時保持3.5 h吸光值下降約66.7%，70 ℃時幾乎完全褪色。Martelli等在鈍頂螺旋藻藻藍蛋白溶液中添加62%的果糖，在80 ℃時加熱1 h后色值也只能保留50%，HN-54藻藍蛋白在未添加任何穩定劑的情況下經80 ℃時加熱1 h色值仍能保留39%。由此可知，HN-54藻藍蛋白耐熱性能良好，與市場上所使用的藻藍蛋白耐熱性相比有較明顯的優勢，這一特性很可能與HN-54藻株具有高溫適應性有關，在高溫狀態時其細胞內蛋白質非常穩定，因此藻藍蛋白發色團的整體構象在高溫時也能保持穩定狀態。

圖4 HN-54藻藍蛋白在不同溫度下的穩定性Fig.4 The stability of the phycocyanin of HN-54 at different temperatures

2.6.2 光照穩定性試驗 光照對藻藍蛋白色值穩定性的影響如圖5所示。光照強度不同，對藻藍蛋白色值穩定性的影響不同。當光照強度為1000和2000 lux時，藻藍蛋白的吸光值在7 d的保存期內基本保持不變。當光照強度為3000和4000 lux時，吸光值在第3 d時有所下降隨后逐漸趨于穩定，吸光值分別保留了94.1%和94.8%。當光照強度為5000和6000 lux時，吸光值在第7 d時均保留了91.4%。由此可見，在7 d的觀察時間內，藻藍蛋白對光照較為穩定，沒有發生嚴重的褪色現象。張巖等研究表明，螺旋藻藻藍蛋白置于室內自然光環境下2 d吸光值就下降了約50.0%。Wu等將鈍頂螺旋藻藻藍蛋白連續暴露于 100 μmol/m·s 環境下 36 h，最終藻藍蛋白濃度下降約21.6%，且光照強度越高，降解程度越高。可見HN-54藻藍蛋白在光照穩定性方面與其他藻藍蛋白相比具有更好的表現。藻藍蛋白吸光度的降低可能是因為當藻藍蛋白置于強光下或是長期暴露在光照下，會導致其失去發色團，從而導致其穩定性降低，藍色逐漸消失。因此，為延長藻藍蛋白的保存時間，最好避光放置，以防止藻藍蛋白結構被光破壞。

圖5 HN-54藻藍蛋白在不同光照強度下的穩定性Fig.5 The stability of the phycocyanin of HN-54 at different illumination strength

2.6.3 酸堿穩定性試驗 酸堿對藻藍蛋白穩定性影響結果如圖6所示。在pH6.0和pH8.0時，藻藍蛋白吸光值基本保持不變，藻藍蛋白非常穩定。在酸性條件下，pH4.0時藻藍蛋白吸光值比中性條件下的吸光值高14.8%；pH2.0時，藻藍蛋白在3.5 h后吸光值下降了28.8%。在堿性條件下，pH10.0時在1 h吸光值下降了10.6%，此后直至3.5 h基本保持穩定；pH12.0時吸光值明顯下降，在3.5 h后吸光值下降了65.3%。結果表明，藻藍蛋白在pH4.0～10.0的范圍內較為穩定，但在極端酸性和堿性條件下穩定性較差，特別是在堿性條件下對色值影響較大。劉楊等研究表明，鈍頂螺旋藻藻藍蛋白在中性環境下（pH7.0～8.0）穩定性良好，超出此范圍穩定性開始下降；在堿性環境下，HN-54藻藍蛋白與鈍頂螺旋藻藻藍蛋白類似，穩定性下降較明顯。pH是影響藻藍蛋白在溶液中以單體、三聚體、六聚體形式聚集比例的主要因素。藻藍蛋白的穩定性依賴于蛋白質的聚集狀態，有報道表明，六聚體是最穩定的結構，能避免藻藍蛋白發生變性，而在較高或較低的pH下，這種結構很容易解離，從而導致穩定性降低，發生褪色。本試驗表明，該藻藍蛋白在pH4.0～8.0范圍內高度穩定，可能是溶液中六聚體占主導地位，從而導致觀察到較高的穩定性。因此，為了保護藻藍蛋白的高溶解度和吸光度，最好在弱酸性和中性的環境下使用。

圖6 HN-54藻藍蛋白在不同pH條件下的穩定性Fig.6 The stability of the phycocyanin of HN-54 at different pH

圖7是藻藍蛋白溶液在不同pH條件下的吸收光譜圖，從圖中可見，藻藍蛋白的特征吸收峰波長在較強酸堿條件下發生了偏移，pH4.0、pH6.0、pH8.0的特征吸收峰保持在620 nm，pH2.0的吸收峰紅移到625 nm，pH10.0的吸收峰藍移到615 nm，該結果表明pH會影響藻藍蛋白特征吸收峰的位置，另外，從特征吸收峰的吸收強度可以看出，在強酸和強堿環境下，藻藍蛋白發生了較明顯的褪色。

圖7 HN-54藻藍蛋白在不同pH條件下的吸收光譜Fig.7 The absorption spectrum of the phycocyanin of HN-54 at different pH

3 結論

本研究從湖南一處溫泉分離得到的藻株為嗜熱聚球藻屬（）的一支，但其種一級的分類學地位尚不能確定。該藻為桿狀單細胞結構，直或有時彎曲，二分裂殖。該藻可以得到純度為0.941、色價為196.53的藻藍蛋白粗提物，得率為11.37%（對藻干物質）。該藻所含藻藍蛋白具有良好的熱、光和酸堿穩定性。在60 ℃保持3.5 h色值不變，在70 ℃處理3.5 h仍保留73.3%的吸光值，在6000 lux光照7 d，色值可保持91.4%，在pH4.0～8.0保持3.5 h色值穩定，該藻藍蛋白在食品加工領域具有良好的應用前景。

熱不穩定是藻藍蛋白市場開發應用最主要的限制條件之一，HN-54藻藍蛋白表現出比市場上絕大多數藻藍蛋白更好的耐熱性，可以作為耐熱性藻藍蛋白的一個潛在來源，盡管目前的熱穩定水平尚需要進一步提高才能滿足食品工業更廣泛的應用，但是其在較高熱穩定性的基礎上具備更好的條件進一步優化以滿足嚴苛的食品加工條件。