lncRNA NRON靶向miR-185-5p調節乳腺癌細胞化療耐藥性的機制研究

汪伶俐，田武國，趙健潔，羅東林

乳腺癌是女性最主要的惡性腫瘤[1]。乳腺癌和其他惡性腫瘤一樣，由多種復雜的因素影響細胞增殖與凋亡的失衡、促癌與抑癌基因結構功能的改變、耐藥蛋白及信號轉導通路的異常，而最終影響細胞行為的進一步惡化[2]。尋找新的抗癌靶點及探尋耐藥機制一直是癌癥研究的重點。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)可海綿化和隔離微小RNA(miRNA)以調節靶蛋白，影響細胞結構及功能機制的改變，因而受到研究者的關注[3]。長鏈非編碼RNA抑制因子活化T細胞(lncRNA NRON)是活化T細胞的非編碼抑制物，近來研究發現其在乳腺癌組織中表達降低[4]，但lncRNA NRON是否影響乳腺癌化療耐藥性還不明確。miRNA中的miR-185-5p在不同癌癥中具有不同作用，已有研究發現，miR-185-5p在乳腺癌中高表達具有促癌及促進耐藥性產生的作用[5]，但miR-185-5p功能的異常是否受lncRNA NRON的調控，目前還未見研究。本研究用基因預測軟件發現lncRNA NRON與miR-185-5p之間有靶向結合關系，并體外培養乳腺癌細胞，探究干預lncRNA NRON表達后，對miR-185-5p調控及耐藥性產生的影響，以期為乳腺癌的基因靶向治療提供新的思路，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：(1)收集2016年7月—2020年7月陸軍軍醫大學大坪醫院乳腺甲狀腺外科行乳腺癌切除患者26例的癌組織及距癌組織大于2 cm處的癌旁組織標本，于-80℃保存備用。患者均為女性，年齡35～79(56.50±5.20)歲；臨床分期：T1～2期20例，T3～4期6例；組織學分級：Ⅰ級5例，Ⅱ級13例，Ⅲ級8例；ER陽性21例，PR陽性20例，HER-2擴增11例；分化程度：高、中分化12例，低分化14例。(2)健康清潔級Balb/c雌性裸鼠，購自廣州銳格生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK(粵)2021-0059；本實驗符合3R原則，經本院動物倫理委員會批準同意[IACUC-01(2021110026)]。(3)正常乳腺上皮細胞系(MCF10A)及乳腺癌細胞系(MCF7、MDA-231、T47D、SKBR3、ZR7530、BT549、HCC1937、BT474)均購自上海淳麥生物科技有限公司。

1.1.2 試藥與試劑：5-氟尿嘧啶(5-FU)、順鉑(DDP)、紫杉醇(PTX)等購自上海源葉公司；逆轉錄試劑盒購自上海研卉生物公司；Lipofectamine 3000轉染試劑盒購自上海恒斐生物公司；lncRNA NRON過表達載體(plasmid NRON)及其陰性對照(NC)、miR-185-5p模擬物(miR-185-5p mimic)及陰性對照(mimic NC)等均由生工生物工程(上海)公司提供；胸苷酸合成酶(TS)抗體購自美國abcam公司。

1.1.3 儀器設備：紫外分光光度儀購自上海精密儀器儀表有限公司；FACSCalibur購自美國BD公司；光學顯微鏡(光鏡)購自上海豫光儀器有限公司。

1.2 實驗方法 2020年8月—2021年12月于陸軍軍醫大學大坪醫院中心實驗室進行實驗。正常乳腺上皮細胞系及乳腺癌細胞系于37℃水浴復蘇，取適量用含10%胎牛血清的DMEM培養基進行傳代培養及計數。取對數期MCF7細胞系，按1×105個/孔接種于6孔板內，Lipofectamine 3000轉染試劑轉染lncRNA-NRON過表達載體(plasmid NRON)及其陰性對照(NC)，設置為plasmid NRON組、NC組，每組設置6個復孔。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測lncRNA NRON、miR-185-5p基因表達：乳腺癌及癌旁組織標本或細胞經粉碎、勻漿，提取RNA，反轉錄得到cDNA，行PCR反應，反應體系：上下游引物各1.0 μl，2×SYBR mix 10 μl，H2O 10 μl，10×cDNA模板1 μl。反應條件：95 ℃預變性35 min、95 ℃變性60 s、60 ℃退火70 s、75 ℃延伸35 min，55個循環。lncRNA NRON以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參，miR-185-5p以U6為內參，應用2-ΔΔCT法計算各基因相對表達量。各引物序列由上海生工生物公司合成。

1.3.2 細胞計數(CCK-8)法檢測細胞增殖及IC50、R值：取轉染后的plasmid NRON組及NC組細胞，分別加入不同濃度的5-FU(0、25、50、100、150、200 mg/L)、DDP(0、1、2.5、5、7.5 mg/L)、PTX(0、1、5、10、20、40 μg/L)，培養72 h時，CCK-8試劑20 μl干預培養4 h，紫外分光光度儀(450 nm)上讀取吸光度(OD)值，根據OD值繪制生長曲線，計算細胞對5-FU、DDP、PTX的半數抑制濃度(IC50)值，計算耐藥指數(R，各組化療藥物IC50值的比值)。plasmid NRON組及NC組細胞在5-FU(100 mg/L)、DDP(5 mg/L)、PTX(10 μg/L)條件下分別培養0 h、24 h、48 h、72 h，CCK-8試劑20 μl干預培養4 h，紫外分光光度儀450 nm處讀取OD值，根據OD值繪制生長曲線，計算增殖活性。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率：plasmid NRON組及NC組細胞在5-FU(100 mg/L)、DDP(5 mg/L)、PTX(10 μg/L)條件分別培養72 h，收集細胞，70%乙醇固定，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒和FACSCalibur系統進行細胞凋亡分析，ModFit LT軟件分析細胞凋亡率。

1.3.4 Western-blot法檢測各組MCF7細胞中胸苷酸合成酶(TS)蛋白表達：細胞粉碎勻漿并提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白總濃度，取蛋白80 μg行電泳及轉膜操作，滴加1∶600的一抗(TS)及1∶900的內參β-actin抗體孵育24 h，辣根過氧化物酶二抗孵育30 min,化學發光液浸膜曝光，Bio-Rad圖像掃描條帶，Alpha Ease FC軟件計算條帶灰度值。

1.3.5 裸鼠荷瘤實驗檢測過表達lncRNA NRON對5-FU、DDP、PTX化療的敏感性：plasmid NRON組及NC組細胞，調整細胞濃度為1.0×108個/ml，取0.2 ml接種于裸鼠腋下，2周后裸鼠右腋下可觸及瘤塊，視為接種成功，并分別腹腔注射5-FU(20 mg/kg)[6]、DDP(30 mg/kg)[7]、PTX(15 mg/kg)[8]，3天1次，連續干預4周。干預結束后游標卡尺檢測瘤體體積(瘤體體積=長徑×短徑2/2)，處死裸鼠，剝離瘤體，精密稱重，瘤體組織經4%多聚甲醛固定制成5 μm石蠟切片，脫蠟及透化處理后，加入1∶200兔抗人ki67抗體孵育過夜，生物素IgG二抗孵育1.5 h，蘇木精復染并于光鏡下觀察拍照。

1.3.6 雙熒光素酶實驗驗證lncRNA NRON與miR-185-5p的靶向關系：Starbase網站預測lncRNA NRON與miR-185-5p存在互補配對的堿基序列。建立含有miR-185-5p結合位點的NRON野生型(WT)和突變型(MUT)片段，并分別克隆至熒光素酶報告質粒中，以合成NRON-3'UTR-WT及NRON-3'UTR-MUT質粒，用Lipofectamine 3000轉染試劑在293T細胞中共轉染mimic NC或miR-185-5p mimic，48 h后，用雙熒光素酶報告分析系統檢測熒光素酶活性。

1.3.7 過表達miR-185-5p對lncRNA NRON作用的逆轉性研究：設置NC組、plasmid NRON組、plasmid NRON+miR-185-5p mimic組、plasmid NRON+mimic NC組，NC組、plasmid NRON組細胞處理同前；plasmid NRON+miR-185-5p mimic組及plasmid NRON+mimic NC組，在plasmid NRON組基礎上，分別轉染miR-185-5p mimic及mimic NC試劑。轉染后分別接種于裸鼠皮下，給予5-FU、DDP、PTX化療藥物干預后，檢測瘤體體積及TS蛋白表達情況。

2 結 果

2.1 乳腺癌組織、癌旁組織及細胞系中lncRNA NRON的表達比較 與癌旁組織比較，乳腺癌組織中lncRNA NRON表達降低(P<0.05)。與正常乳腺上皮細胞系(MCF10A)比較，乳腺癌細胞系(MCF7、MDA-231、T47D、SKBR3、ZR7530、BT549、HCC1937、BT474)中lncRNA NRON表達均降低(P<0.05)，其中MCF7細胞系中lncRNA NRON表達最低，見表1。

表1 正常乳腺上皮細胞系及乳腺癌細胞系中lncRNA NRON表達比較

2.2 上調lncRNA NRON對MCF7細胞化療耐藥性的影響 與NC組比較，plasmid NRON組細胞lncRNA NRON表達升高(0.45±0.01 vs.1.33±0.06,P<0.05)。

NC組及plasmid NRON組細胞分別經不同濃度5-FU、DDP、PTX干預培養72 h后，與NC組比較，plasmid NRON組細胞IC50值及R值降低(P<0.05)，見圖1、表2。NC組及plasmid NRON組細胞在5-FU、DDP、PTX干預培養條件下，與NC組比較，plasmid NRON組細胞OD值降低，在72 h時差異最顯著(P<0.05)，見圖2。plasmid NRON組細胞凋亡率及TS蛋白表達升高(P<0.05)，見圖3、4，表3。裸鼠荷瘤實驗發現，接種plasmid NRON細胞的裸鼠，經5-FU、DDP、PTX治療后，瘤體體積及ki67表達明顯低于NC組(P<0.05)，見圖5、表4。

表2 2組MCF7細胞對5-FU、DDP、PTX的IC50及R值比較

表3 5-FU、DDP、PTX干預培養后2組細胞凋亡率及TS蛋白表達比較

表4 5-FU、DDP、PTX干預培養后2組瘤體體積及ki67表達水平比較

注：與NC組比較，aP<0.05

注：與NC組比較，aP<0.05

圖3 2組流式凋亡檢測圖

注：A.NC組；B.plasmid NRON組

圖5 2組瘤體組織ki67免疫組化染色圖(×200)

2.3 lncRNA NRON與miR-185-5p的靶向關系 乳腺癌組織中miR-185-5p表達顯著高于癌旁組織(3.22±0.21 vs. 1.00±0.13,t=45.833,P<0.001)，在癌細胞系中表達高于正常乳腺上皮細胞系(P<0.05)，見表5。與NC組比較，lncRNA NRON組MCF7細胞中miR-185-5p表達下調(0.33±0.42 vs. 1.45±1.45)(t=30.333,P<0.05)。

表5 正常乳腺上皮細胞系及乳腺癌細胞系中miR-185-5p表達比較

生物信息學Starbase數據庫預測試驗及雙熒光素酶報告試驗發現，lncRNA NRON與miR-185-5p之間有靶向結合位點，293T細胞共轉染miR-185-5p mimic和無突變的lncRNA NRON-WT載體，可使293T細胞中熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)，而共轉染miR-185-5p mimic和發生突變的lncRNA NRON-MUT載體對熒光素酶活性無顯著作用(P>0.05)，見圖6、7。

圖6 lncRNA NRON與miR-185-5p靶向結合位點預測

2.4 miR-185-5p過表達對上調lncRNA NRON后癌細胞化療耐藥性的影響 與plasmid NRON組比較，miR-185-5p mimic+plasmid NRON組裸鼠瘤體體積升高，TS蛋白降低(P<0.05)，而plasmid NRON組與plasmid NRON+mimic NC組比較上述指標差異無統計學意義(P>0.05)，見圖8、表6。

表6 經5-FU、DDP、PTX治療后各組裸鼠瘤體體積及TS蛋白表達比較

注：與mimic NC比較，aP<0.05

注：A.NC組；B.plasmid NRON組；C.plasmid NRON+mimic NC組；D.plasmid NRON+miR-185-5p mimic組

3 討 論

乳腺癌是一個重大的公共衛生問題，并在全球范圍內造成重大的醫療負擔[9]。乳腺癌發生發展的潛在機制仍不明確。lncRNA已在各種癌癥中得到廣泛研究，且已成為乳腺癌干預的新靶點。lncRNA可作為信號分子來調節下游基因的轉錄，并與蛋白質(通常是轉錄因子)相互作用而抑制蛋白質的功能，且海綿化和隔離miRNA及調節靶蛋白表達參與細胞周期、抗藥產生等生物學行為過程[10]。lncRNA NRON反向定位在9q33.3，長2 730 nt，是T細胞核因子NFAT的非編碼RNA抑制物，是常見的影響細胞核運輸的RNA[11]。已有研究發現，lncRNA NRON在乳腺癌組織中表達降低，且與乳腺癌患者生存及預后關系密切[12,4]。化療藥物耐藥性產生，一直是影響乳腺癌患者生存的關鍵因素[13]。5-FU、DDP、PTX是目前癌癥治療較為常見的化療藥物[14]。本研究發現，在乳腺癌組織中lncRNA NRON表達明顯低于癌旁組織，與Niu等[4]的研究一致，說明lncRNA NRON在乳腺癌中可能發揮抑癌作用。用不同濃度的5-FU、DDP、PTX與乳腺癌細胞系MCF7培養后，隨著耐藥性的產生，lncRNA NRON表達也隨之降低，反之上調lncRNA NRON表達后，MCF7細胞系對5-FU、DDP、PTX的耐藥性明顯降低，乳腺癌細胞表現為較低的增殖及較高的凋亡水平，提示干預lncRNA NRON表達可能是提高乳腺癌細胞對化療藥物敏感性的潛在策略。但lncRNA NRON參與調控耐藥性產生的下游調控機制還不甚明確。

lncRNA NRON可通過海綿化和隔離miRNA來影響細胞功能變化。但lncRNA NRON通過哪種途徑調控乳腺癌細胞耐藥性產生還不明確。本研究通過基因預測軟件發現，lncRNA NRON與miR-185-5p之間有靶向結合關系，且lncRNA NRON可靶向下調miR-185-5p，推測lncRNA NRON很可能通過海綿化和隔離miR-185-5p來發揮增敏作用。查閱大量文獻發現，miRNA中的miR-185-5p與乳腺癌異常增殖、凋亡及化療耐藥性產生關系密切[15-16]，且miR-185-5p可通過破壞嘧啶核苷酸的合成酶(UMPS)、二氫嘧啶脫氫酶(DPD)、TS等合成，阻擾5-FU、DDP、PTX在癌細胞內分解及代謝，進而減弱化療藥物對癌細胞的毒殺作用[17,5]。本研究發現，miR-185-5p在乳腺癌組織和細胞系中顯著高表達，與既往研究一致[5]，與lncRNA NRON表達趨勢剛好相反，提示miR-185-5p作為促癌因子在乳腺癌中起作用，且可能與lncRNA NRON存在靶向關系，雙熒光素酶實驗驗證了這一推測。此外，過表達lncRNA NRON增加乳腺癌化療藥物敏感性的同時，miR-185-5p表達顯著降低，具有促進化療效率的TS表達卻顯著升高[18]，乳腺癌表現出較低的增殖率和較高的凋亡率，證實lncRNA NRON提高化療藥物敏感性作用可能與調節miR-185-5p有關。為了進一步驗證這一推測，本研究在過表達lncRNA NRON的同時上調miR-185-5p表達，并接種于裸鼠體內，經化療藥物干預后，發現裸鼠接種lncRNA NRON及miR-185-5p高表達細胞的瘤體體積增長明顯高于單獨接種lncRNA NRON高表達的裸鼠，提示miR-185-5p高表達可明顯削弱lncRNA NRON發揮的降低化療藥物耐藥性作用。說明lncRNA NRON通過靶向負調控miR-185-5p抑制乳腺癌細胞的化療耐藥。

綜上所述，lncRNA NRON可通過靶向下調miR-185-5p，來降低乳腺癌對化療藥物的耐藥性。這為乳腺癌的化療治療提供新的干預策略。但miR-185-5p高表達并不能完全逆轉lncRNA NRON降低化療藥物耐藥性的作用，提示lncRNA NRON的下游干預機制可能涉及多個miRNA，這需要后續進行深入探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明：

汪伶俐：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；田武國：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核;趙健潔：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;羅東林：進行統計學分析，課題設計，論文撰寫