急性呼吸窘迫綜合征患兒血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平變化及臨床意義

宋宇雷，曹建設，王承娟，賀杰，肖政輝，張新萍

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由肺泡表面活性劑的原發性或繼發性減少引起的一種以氣體交換異常和急性低氧性呼吸衰竭為特征的呼吸系統疾病，進展快、預后差，是導致兒科重癥監護室患兒死亡的重要原因[1-2]。及時評估ARDS患兒病情嚴重程度和預后對患兒預后改善有重要意義。研究表明，失控性炎性反應和肺泡上皮細胞、毛細血管內皮細胞損傷參與ARDS發生發展[3-4]。微小RNA(microRNA，miRNA)參與多種細胞因子轉錄調控，在ARDS炎性反應中扮演重要角色[5]。研究報道，上調miR-499-5p表達能抑制膿毒癥誘導的肺組織炎性反應[6]。基質金屬蛋白酶16(matrix metallopeptidase 16，MMP-16)是一種膜結合型酶，能通過激活MMP2、MMP9參與上皮細胞和毛細血管內皮細胞損傷[7-8]。目前，關于血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平與ARDS患兒病情嚴重程度和預后的關系尚無研究報道，因此現對其進行研究以期為改善ARDS患兒預后提供參考依據，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月—2022年1月湖南省兒童醫院重癥醫學科收治的ARDS患兒105例作為ARDS組，其中男71例，女34例；年齡1～12(5.68±1.56)歲；體質量12～51(25.47±6.22)kg；ARDS病因：感染54例，創傷22例，肺栓塞24例，其他5例；參考“小兒急性呼吸窘迫綜合征：小兒急性肺損傷會議共識推薦”[9]根據氧指數(OI)分為輕度亞組39例(OI 4～<8)、中度亞組42例(OI 8～<16)、重度亞組24例(OI≥16)。并根據ARDS患兒28 d臨床結局分為存活亞組88例和死亡亞組17例。另選取同期醫院體檢健康兒童47例為健康對照組，其中男29例，女18例；年齡1～12(5.74±1.60)歲；體質量12～54(25.42±5.62)kg；2組兒童一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準(2019倫字023)，受試兒家屬或監護人知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①符合“小兒急性呼吸窘迫綜合征：小兒急性肺損傷會議共識推薦”[9]中小兒ARDS診斷標準；②年齡1～12歲。(2)排除標準：①先天性疾病；②膈疝、表面活性物質、肺腺瘤樣畸形等遺傳性缺陷；③腦性過度換氣；④惡性腫瘤；⑤嚴重肝腎功能障礙；⑥資料不全。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA檢測：收集ARDS組入院時、健康對照組入組時受試兒肘靜脈血3 ml，離心取上層血清保存于-80℃冰箱中待測。Trizol試劑盒(上海冠泰生物科技有限公司)提取血清總RNA，純度、濃度合格后使用反轉錄試劑盒(日本TaKaRa Bio公司)逆轉錄合成cDNA，反轉錄體積10 μl：5×PrimeScript RT Master Mix 2.0 μl、RNA 2.0 μl、RNase Free H2O 6.0 μl；反應條件：37℃逆轉錄反應15 min、85℃逆轉錄酶失活反應5 s、4℃反應至結束后保存于-20℃冰箱中。按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa Bio公司)進行PCR擴增：miR-499a-5p正向引物 5′-ACTGCTTAAGACTTGGAGTGA-3′，反向引物 5′-TACATTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′；內參U6正向引物 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；MMP-16 mRNA正向引物 5′-AGCACTGGAAGACGGTTGG-3′，反向引物 5′-CTCCGTTCCGCAGACTGTA-3′；內參GAPDH正向引物 5′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3′，反向引物 5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′。PCR反應體積20 μl：SYBR?Premix Ex Taq 10 μl、正反向引物各0.8 μl、cDNA模板2.0 μl、ROX Reference Dye 0.4 μl、RNase Free H2O 6.0 μl；反應條件：95℃預變性90 s、95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s，循環40次后收集熔解曲線，采用2-ΔΔCT法計算血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA相對表達量。

1.3.2 動脈血氣分析：ARDS患兒入兒科重癥監護室后首次機械通氣時與健康對照組體檢時采用丹麥雷度米特ABL9血氣分析儀進行動脈血氣分析，包括動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動脈血氧分壓(PaO2)、血氧飽和度(SaO2)、吸入氧濃度、平均氣道壓，并計算氧指數(oxygen index，OI)=吸入氧濃度×平均氣道壓×100/PaO2。

2 結 果

2.1 2組血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平比較 ARDS組血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平分別為(1.27±0.31)、(3.08±0.62)，健康對照組分別為(2.85±0.46)、(1.07±0.37)，ARDS組血清miR-499a-5p水平低于健康對照組，MMP-16 mRNA水平高于健康對照組(t=21.349、24.932，P均<0.001)。

2.2 不同亞組間ARDS患兒血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平比較 輕度亞組、中度亞組、重度亞組血清miR-499a-5p水平依次降低，MMP-16 mRNA水平依次升高(P均<0.01)。死亡亞組血清miR-499a-5p水平低于存活亞組，MMP-16 mRNA水平高于存活亞組(P均<0.01)，見表1。

表1 不同亞組ARDS患兒血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平比較

2.3 2組動脈血氣分析比較 ARDS組PaCO2、OI高于健康對照組，PaO2、SaO2低于健康對照組(P均<0.01)，見表2。

表2 ARDS組與健康對照組動脈血氣分析指標比較

2.4 ARDS患兒血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平與血氣分析指標的相關性 經https://www.targetscan.org/vert_72/網站預測，miR-499a-5p與MMP-16的3′-非翻譯區存在結合位點(圖1)。Pearson/Spearman相關性分析顯示，ARDS患兒血清miR-499a-5p與MMP-16 mRNA水平呈負相關(r=-0.603，P<0.001)；ARDS患兒血清miR-499a-5p水平與PaCO2、OI呈負相關，與PaO2、SaO2呈正相關(P均<0.01)，MMP-16 mRNA水平與PaCO2、OI呈正相關，與PaO2、SaO2呈負相關(P均<0.01)，見表3。

圖1 miR-499a-5p與MMP-16結合位點示意圖

表3 ARDS患兒血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平與血氣分析指標的相關性

2.5 血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平對ARDS患兒死亡的預測價值 ROC曲線分析顯示，血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平及二者聯合預測ARDS患兒死亡的AUC分別為0.793、0.781、0.888，二者聯合預測ARDS患兒死亡的AUC大于單獨預測(Z=1.995、2.162，P=0.046、0.031)，見表4、圖2。

圖2 血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平單獨與聯合預測ARDS患兒死亡的ROC曲線

表4 血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平及二者聯合對ARDS患兒死亡的預測價值

3 討 論

小兒ARDS是臨床常見的危重癥，與成人ARDS具備肺容積減少、肺順應性降低和通氣/血流比值失常等相似的病理特征，但在病因、危險因素、合并癥和治療預后方面仍存在較大差異[10]。2015年國際上首次制定了小兒ARDS共識，新共識根據OI或脈氧飽和度指數定義小兒ARDS和病情分級，而非成人ARDS的氧合指數[9-11]。盡管近年來高級呼吸護理、外源性表面活性劑、營養和液體管理、皮質類固醇等方式和藥物極大地改善了ARDS患兒預后，但病死率仍高達17.3%～21.2%[2,12]。因此，早期評估其病情嚴重程度和預后意義重大。

研究表明，失控性炎性反應參與ARDS發生發展，各種病因能直接或間接通過炎性反應破壞肺泡—毛細血管屏障中的肺泡上皮和肺毛細血管內皮，導致肺水腫和血管通透性增加，使肺功能持續惡化[3]。miRNA是一類小非編碼RNA分子，通過與mRNA的3′-非翻譯區互補配對調控基因表達，進而參與ARDS發生發展[13-14]。如miR-223能靶向NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3抑制肺微血管內皮細胞炎性反應、氧化應激和凋亡[15]。miR-224能靶向抑制p21增加肺微血管內皮細胞損傷[16]。miR-499a-5p是一種高度保守的miRNA，定位于人20號染色體q11.22，既往研究多報道其與惡性腫瘤的關系，近年研究發現，miR-499a-5p還是一個與炎性反應密切相關的miRNA。在脂多糖建立膿毒癥心肌功能障礙模型中，上調miR-499a-5p能抑制膿毒癥心肌功能障礙發生[17]。Guan等[18]通過氧—糖剝奪建立星形膠質細胞炎性反應發現，上調miR-499a能靶向第10號染色體缺失的磷酸酶抑制星形膠質細胞炎性反應。上述研究提示，miR-499a-5p具有抗炎作用。且近期研究指出，miR-499-5p能靶向SRY-Box轉錄因子6抑制膿毒癥誘導的肺損傷[6]。本研究結果顯示，ARDS患兒血清miR-499a-5p水平明顯降低，且隨著病情加重而降低，說明血清miR-499a-5p水平降低參與小兒ARDS發生發展，分析可能與miR-499a-5p具有抗炎作用有關。段凌霄等[19]研究也報道，在盲腸穿刺構建的ARDS大鼠模型中，上調miR-499a-5p表達能抑制肺泡上皮細胞中白介素-1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α等促炎因子表達，減輕ARDS大鼠肺組織損傷。

肺泡上皮、肺毛細血管內皮和基底膜等構成的肺泡—毛細血管屏障破壞是ARDS發生的核心環節，基底膜降解是肺泡—毛細血管屏障破壞的重要原因之一[20-21]。MMPs是多種組織和細胞產生的一種膠原蛋白水解酶，因其能降解細胞外基質的各種蛋白組分而受到廣泛關注，同時MMPs還能導致細胞—基質和細胞—細胞間作用變化，激活多種細胞因子和表面受體，參與炎性反應發生發展[22]。MMP2和MMP9是MMP家族常見成員，近年研究表明，MMP2、MMP9能通過炎性反應和降解細胞外基質破壞肺泡—毛細血管屏障，參與ARDS發生發展[23-25]。MMP-16是MMPs家族中的一種膜結合型酶，也被稱為膜型MMP2和膜型MMP3，能通過切割MMP2、MMP9的前結構域促進MMP2、MMP9激活[8]。本研究結果顯示，ARDS患兒血清MMP-16 mRNA水平明顯升高，且隨著病情加重而升高，說明血清MMP-16 mRNA水平升高參與小兒ARDS發生發展，分析可能與MMP-16 mRNA表達上調能促進MMP2、MMP9表達，二者通過炎性反應和降解細胞外基質破壞肺泡—毛細血管屏障參與ARDS發生發展有關。本研究通過TargetScan 7.2數據庫預測發現，miR-499a-5p與MMP-16的3′-非翻譯區存在結合位點，Pearson相關性分析也顯示，二者在ARDS患兒血清中表達呈負相關，提示miR-499a-5p與MMP-16可能共同參與小兒ARDS發生發展。有研究通過熒光素酶報告基因實驗證實，上調miR-499a-5p能靶向下調MMP-16表達，降低肺泡中促炎細胞因子表達，減輕ARDS大鼠的肺損傷[19]。進一步證實miR-499a-5p、MMP-16共同參與ARDS發生發展。本研究通過分析血清miR-499a-5p、MMP-16水平與ARDS患兒預后的關系發現，與存活亞組比較，死亡亞組血清miR-499a-5p水平明顯降低而MMP-16 mRNA水平明顯升高，提示血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平還與ARDS患兒預后有關。ROC曲線分析也顯示，血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平預測ARDS患兒死亡的AUC分別為0.793、0.781，說明二者可作為ARDS患兒預后的輔助預測指標。分析原因可能是血清miR-499a-5p越低和MMP-16 mRNA水平越高反映ARDS患兒肺泡—毛細血管屏障破壞越嚴重，導致肺功能和結構進一步惡化，因此死亡風險更高。同時本研究ROC曲線分析還顯示，血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平聯合預測ARDS患兒死亡的AUC為0.888，較二者單獨預測的AUC顯著增加，說明聯合檢測血清miR-499a-5p、MMP-16 mRNA水平能提升ARDS患兒預后預測價值，有利于指導臨床制定治療對策以改善ARDS患兒預后。

綜上所述，ARDS患兒血清miR-499a-5p水平低表達，MMP-16 mRNA水平高表達，二者可能共同參與小兒ARDS發生發展，與ARDS患兒病情嚴重程度和預后密切相關，可作為ARDS患兒預后預測指標。但本研究樣本量較少，還需多中心大樣本研究進一步證實；同時關于miR-499a-5p、MMP-16參與ARDS的機制有待進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

宋宇雷：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;曹建設：課題設計，論文撰寫;王承娟：進行統計學分析；賀杰：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；肖政輝、張新萍：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核