基于循環(huán)microRNAs預(yù)測模型在子癇前期早期診斷中的應(yīng)用

許琳，王茹，張忠霞，黃素靜，羅書

子癇一直以來是影響孕婦及胎兒的重要疾病，其對于整個孕期會造成嚴(yán)重的影響，甚至影響胎兒發(fā)育，最終導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[1]。研究結(jié)果顯示，在子癇前期明確診斷并采取相應(yīng)治療措施能顯著改善妊娠結(jié)局，但由于子癇發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，故目前對于子癇的早期診斷一直以來是產(chǎn)科臨床研究的熱門方向[2-3]。 國內(nèi)外研究證實(shí)，循環(huán)微小RNA(microRNAs)與子癇前期關(guān)系密切[4-6]。基于此，分析多個循環(huán)microRNAs與子癇前期的相關(guān)性，并建立預(yù)測模型，旨在為子癇前期的預(yù)測提供新方向，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年1月—2021年6月于海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科行產(chǎn)檢并具有子癇前期危險因素的孕婦(孕周≥20周)246例作為研究對象。經(jīng)過6個月隨訪后，246例孕婦中確診子癇前期71例(28.86%)，并根據(jù)子癇前期確診情況分為子癇組71例和非子癇組175例。子癇組子癇家族史、高血壓、腎臟疾病、24 h尿蛋白≥0.3 g占比及MAP高于非子癇組，PLT、Alb低于非子癇組(P均<0.01)，2組其他資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn) (HN20190103027)，孕婦及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

表1 子癇組與非子癇組臨床資料比較

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)： 參照“妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)”中對于子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)，妊娠期間達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)則確診子癇前期[7]。②符合子癇前期危險因素中至少1項(xiàng)，包括既往子癇前期史或子癇前期家族史、高血壓遺傳因素等；年齡≥35歲；妊娠前BMI≥28 kg/m2；高血壓病、腎臟疾病、糖尿病；初次妊娠、妊娠間隔時間≥10年；收縮壓≥130 mmHg或舒張壓≥80 mmHg(首次產(chǎn)前檢查時、妊娠早期或妊娠任何時期檢查時)；妊娠早期尿蛋白定量≥0.3 g/24 h或持續(xù)存在隨機(jī)尿蛋白陽性)。③孕周≥20周。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①產(chǎn)前檢查記錄不完整；②伴有除子癇外的其他妊娠疾病；③既往惡性腫瘤疾病史；④自身免疫性疾病史或家族史。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 qRT-PCR檢測外周血microRNAs水平：入組后取清晨孕婦空腹肘靜脈血2 ml，提取總RNA后使用美國ABI公司提供 Step-One Plus Detection將總RNA通過PCR法反向轉(zhuǎn)錄到cDNA，而后將cDNA、qRT-PCR引物(見表2)及相關(guān)酶組成qRT-PCR反應(yīng)體系后加入real-time PCR分析儀中，反應(yīng)過程：預(yù)變性95℃ 30 s、變性95℃ 5 s、退火60℃ 44 s，總共進(jìn)行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法，以U6為內(nèi)參，計算miR-16、miR-21、miR-31、miR-136、miR-494及miR-495表達(dá)量。

表2 實(shí)時定量PCR引物序列

1.3.2 sFlt-1及PlGF檢測：抽取孕婦外周靜脈血2 ml，采用瑞士羅氏公司生產(chǎn)的Roche cobas E 610型免疫分析儀，通過電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測外周血sFlt-1、PlGF水平，并計算sFlt-1/PlGF值。

1.3.3 子宮動脈搏動指數(shù)(uterine artery pulsatility index，UTPI)檢測：使用汕頭市超聲儀器研究所有限公司生產(chǎn)的CTS-5000C型實(shí)時三維超聲診斷儀測量所有孕婦雙側(cè)UTPI，再取雙側(cè)平均值作為UTPI。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以頻數(shù)或率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計量資料以M(Q1,Q3)表示，組間比較采用Manne WhitneyU檢驗(yàn)；采用Logistic回歸分析影響子癇前期發(fā)生的因素；使用R軟件包(×64 for Windows，3.6.1)建立發(fā)生子癇前期的列線圖預(yù)測模型，應(yīng)用一致性指數(shù)(C-index)評估模型預(yù)測性能，并進(jìn)行Bootstrap外部驗(yàn)證，繪制校正曲線，并通過內(nèi)部驗(yàn)證該模型的信度及效度；通過建立ROC曲線比較預(yù)測模型與sFlt-1/PlGF對子癇前期的預(yù)測效能，二者差異比較采用Z檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組循環(huán)microRNAs水平比較 子癇組患者miR-16、miR-21、miR-31、miR-495水平低于非子癇組， miR-136、miR-494水平高于非子癇組(P均<0.05)，見表3。

表3 子癇組與非子癇組循環(huán)microRNAs水平比較 [M(Q1,Q3)]

2.2 2組UTPI及外周血sFlt-1、PlGF水平比較 子癇組患者UTPI及外周血sFlt-1、sFlt-1/PlGF顯著高于非子癇組，而PlGF則顯著低于非子癇組(P均<0.05)，見表4。

表4 子癇組與非子癇組UTPI及外周血sFlt-1、PlGF水平比較 [M(Q1,Q3)]

2.3 影響子癇前期的多因素Logistic回歸分析 以子癇前期為因變量，以上述結(jié)果中P<0.05的指標(biāo)為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，PLT高、Alb高、miR-21高及miR-31高是影響子癇前期發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)因素，而24 h尿蛋白≥0.3 g、UTPI高、sFlt-1/PlGF高是影響子癇前期發(fā)生的獨(dú)立危險因素(P<0.05)，見表5。

表5 影響子癇前期的多因素Logistic回歸分析

2.4 基于循環(huán)microRNAs水平對子癇前期預(yù)測模型的構(gòu)建及驗(yàn)證 根據(jù)多因素Logistic回歸分析結(jié)果，應(yīng)用訓(xùn)練集子癇前期發(fā)生的數(shù)據(jù)建立子癇前期的列線圖預(yù)測模型，列線圖模型預(yù)測子癇前期的C-index為0.947(95%CI0.902～0.979)，區(qū)分度良好，見圖1；經(jīng)Bootstrap自抽樣方法對驗(yàn)證集進(jìn)行外部驗(yàn)證，活動校正曲線，校正曲線顯示列線圖模型預(yù)測可能性絕對誤差為0.009，一致性良好，見圖2。

圖1 影響子癇前期發(fā)生的列線圖

圖2 子癇前期發(fā)生的矯正曲線

2.5 基于循環(huán)microRNAs預(yù)測模型與sFlt-1/PlGF對子癇前期的預(yù)測效能比較 ROC曲線結(jié)果顯示，基于循環(huán)microRNAs水平預(yù)測模型(AUC=0.991,95%CI0.984～0.999)、sFlt-1/PlGF(AUC=0.736,95%CI0.660～0.812)對子癇前期均具有一定的預(yù)測價值(P<0.001)，預(yù)測效能高于sFlt-1/PlGF，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=6.504，P<0.001)，見圖3。預(yù)測模型敏感度、特異度均顯著高于sFlt-1/PlGF，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.218、14.464，P<0.001)，見表6。

表6 預(yù)測模型與sFlt-1/PlGF對子癇前期的預(yù)測價值比較

圖3 基于循環(huán)microRNAs預(yù)測模型與sFlt-1/PlGF對子癇前期預(yù)測的ROC曲線

3 討 論

子癇前期的篩查一直以來是產(chǎn)科臨床工作中的重點(diǎn)，近年來已將普通產(chǎn)檢中預(yù)測子癇的高危因素進(jìn)行了歸納總結(jié)，同時提出了對于高危產(chǎn)婦需要更精確的篩查指標(biāo)來確診子癇的研究方向[8]。在“妊娠期高血壓疾病診治指南(2020年版)”中對于目前臨床上常用的sFlt-1/PlGF指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行了總結(jié)，并說明了此指標(biāo)在診斷敏感度上還存在較大的提升空間[9]。

本次研究在以往研究的基礎(chǔ)上對產(chǎn)婦首先進(jìn)行了高危因素的篩查，目的在于提升檢驗(yàn)的針對性，同時還能減少部分低危產(chǎn)婦進(jìn)行精確篩查的成本。在2組產(chǎn)婦一般資料比較中，子癇組高血壓病史及腎臟疾病病史患者占比較高，這一點(diǎn)在以往研究中已經(jīng)得到了證實(shí)，該研究均指出高血壓及腎臟病史產(chǎn)婦子癇前期發(fā)生率顯著高于普通患者[10-11]。

本研究重點(diǎn)在于通過對子癇前期患者的精確實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)進(jìn)行比較，從而得到更準(zhǔn)確的診斷模型。本研究中所提出的PLT、Alb、24 h尿蛋白≥0.3 g占比及MAP與子癇前期的相關(guān)性已經(jīng)在在既往研究中指出[12-13]。通過Logistic回歸分析篩選結(jié)果將PLT、Alb、24 h尿蛋白≥0.3 g占比、MAP排除獨(dú)立影響因素指標(biāo)，充分說明了上述指標(biāo)特異性較差[14]。而納入獨(dú)立影響因素的指標(biāo)中主要的作用機(jī)制如下：子癇前期由于血流壓力較大，導(dǎo)致妊娠所致的滋養(yǎng)細(xì)胞無法有效的侵襲子宮動脈，從而影響子宮—胎盤循環(huán)，使其仍處于高阻低排狀態(tài)，最終影響子宮動脈的血流動力學(xué)指標(biāo)，子宮動脈搏動指數(shù)則是子宮動脈血流動力學(xué)的重要指標(biāo)[15]；子癇前期患者由于胎盤功能異常會使sFlt-1大量激活，導(dǎo)致sFlt-1/PlGF失衡從而導(dǎo)致子宮血管生成障礙進(jìn)而影響胎盤功能，形成惡性循環(huán)導(dǎo)致胎兒情況惡化[16]。

microRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，已有大量研究顯示，其廣泛參與到人體正常生理活動及病理改變中，是人體正常運(yùn)轉(zhuǎn)的重要因素，也是多種疾病發(fā)生的重要誘因。雖然本次納入研究的microRNAs在2組之間的比較有明顯差異，但通過Logistic分析篩選獨(dú)立影響因素后結(jié)果顯示，miR-16、miR-136、miR-494、miR-495均被排除了獨(dú)立影響因素，通過對比以往研究發(fā)現(xiàn)，miR-136、miR-494及miR-495與子癇相關(guān)在國外研究中提出較多，可能由于種族、地域、生活方式等差異，導(dǎo)致了上述3組microRNAs在本研究樣本中與子癇的相關(guān)性低于其他指標(biāo)[17]。而在Dong等[18]的研究中也提出，在子癇前期孕婦中，miR-16表達(dá)與正常孕婦相關(guān)性低于miR-21、miR-31，本研究結(jié)果與之類似。二者參與機(jī)制如下：(1)miR-21在血管內(nèi)皮細(xì)胞中通過增加eNOS磷酸化及NO的表達(dá)從而達(dá)到防止血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用，而子癇患者miR-21低表達(dá)則會導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷加重[19]；(2)miR-31可以通過降低抑制缺氧誘導(dǎo)因子(FIH1)表達(dá)，從而導(dǎo)致VEGF的上調(diào)和促進(jìn)血管的生成，子癇前期患者由于miR-31表達(dá)被抑制，從而導(dǎo)致FIH1高表達(dá)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，引起血管損傷[20]。基于miR-21及miR-31的列線圖模型預(yù)測子癇前期的結(jié)果顯示，該模型對于子癇前期具有較好的預(yù)測作用，其預(yù)測敏感度及特異度均顯著高于sFlt-1/PlGF，再次說明基于miR-21及miR-31的列線圖模型對于子癇前期具有較好的預(yù)測價值。

本研究為單中心小樣本量研究，對于民族、地域等因素考慮不足，部分指標(biāo)與子癇前期之間的關(guān)系是基于既往研究中推測所得，缺少基礎(chǔ)研究進(jìn)一步證實(shí)。但這并不影響本研究得出的基于miR-21及miR-31的列線圖模型對子癇前期預(yù)測的價值，今后需進(jìn)一步完善相關(guān)基礎(chǔ)研究，深入探討microRNAs與子癇前期之間的具體關(guān)系，并從中獲得對于子癇前期預(yù)測及治療更有意義的指標(biāo)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

許琳：設(shè)計研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；王茹：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；張忠霞：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；黃素靜：進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；羅書：課題設(shè)計，論文撰寫