苗藥驗方對膝骨關節炎家兔血清β-catenin、TNF-α 水平的影響

付鈺 李寶杰 陶陶 古麗玲 羅昌祿 梅建 夏景富

膝骨關節炎(knee osteoarthritis,KOA)是一種慢性退行性關節疾病,主要臨床表現為關節疼痛、功能障礙,從而影響人們的生活質量［1］。貴州地處云貴高原,氣候陰冷潮濕,是膝骨關節炎的高發地區,長期以來,苗族人民在與關節炎抗爭的過程中發現,苗醫藥治療膝骨關節炎療效可靠,便于操作,成本低廉且安全性高。苗藥熏蒸療法屬于苗醫傳統外治法的一種,是通過對皮部的溫熱、藥物、機械等刺激而發揮治療作用,屬于經皮給藥的范疇。離子導入技術是現代經皮給藥技術中研發最早的一種技術,能促使皮膚電阻下降,改善局部血液循環,通過其電場對藥物離子產生定向的推動力來提高藥物的經皮滲透率［2］。本研究用木瓜蛋白酶制備家兔膝骨關節炎模型,觀察苗藥驗方熏蒸療法與離子導入療法對膝骨關節炎家兔血清中β-catenin、TNF-α 水平的影響,探索苗藥治療膝骨關節炎的效應機制,為苗藥的推廣應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 新西蘭大白兔36 只,雌雄各半,體重2.0～2.5 kg,SPF級繁殖飼料飼養,滅菌飲用水飼養,飼養溫度20～26℃,濕度40%～70%。

1.1.2 主要儀器及試劑 定向透藥離子導入儀(FB-312012002,長沙海憑醫療設備有限公司)；數顯恒溫水浴鍋(HH-2,常州天瑞儀器有限公司)；全自動酶標儀(WD-2102B,北京市六一儀器廠)；木瓜蛋白酶(CAS#9001-73-4,上海源葉生物科技有限公司)；兔TNF-α 試劑盒(ED-72292,廈門侖昌碩生物科技有限公司)；兔β-catenin 劑盒(ED-73872,廈門侖昌碩生物科技有限公司)。

1.1.3 苗藥驗方［3］透骨香(杜鵑花科)30 g、白龍須(八角楓科)6 g、土一枝蒿(菊科)10 g、五香血藤(五味子科)10 g、大血藤(木通科)10 g、艾納香(菊科)30 g、艾葉(菊科)15 g 等(貴州貴陽同濟堂藥店)。苗藥制備方法：將以上諸藥用蒸餾水浸泡40 min 后煎煮,煎煮成濃度為68%～70%的藥液備用。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 適應性喂養7 d 后,隨機分為正常對照組、模型組、苗藥熏蒸組、苗藥離子導入組,每組9 只。將4%木瓜蛋白酶溶液(4%木瓜蛋白酶的配制：稱取0.168 g 的木瓜蛋白酶,加入4.2 ml 的生理鹽水完全溶解)0.3 ml 注入模型組、苗藥熏蒸組、苗藥離子導入組的家兔右膝關節腔內［4］,每隔3 d 注射1 次,連續注射3 次,獲得穩定的膝骨關節炎模型后造模完成。

1.2.2 治療方法 苗藥熏蒸組：造模成功后,每日將苗藥置于自制恒溫熏洗箱中,待蒸氣溫度達到39～40℃對家兔進行熏蒸,20 min/次；苗藥離子導入組：造模成功后,用兩片醫用無菌藥墊充分浸濕苗藥液5 ml,包裹在家兔右膝關節,外包連接定向透藥離子導入儀的電極板,外面用繃帶膠布固定,定向透藥離子導入儀持續治療20 min,治療時紅外強度設置為1,能量強度設置為5。以上治療1 次/d,共治療20 d,治療時以與空氣混合的5%異氟烷輕度吸入性麻醉。正常對照組與模型組：造模成功后每日抓拿及輕度麻醉,但不實施治療。

1.2.3 行為學觀察 分別于治療第10、20 天用改良Lequesne MG 的膝關節級別評估方法［5］對四組家兔右膝關節局部反應、步態改變、關節活動范圍及腫脹程度等情況進行評估。

1.2.4 取血與血清的制備 造模成功后第21 天,四組家兔均在無菌條件下心臟采血。所取血液放4℃冰箱靜置過夜,離心(3000 r/min)20 min,取上清,將同組動物血清混合,經0.22 μm 抽濾除菌后,56℃滅活30 min,分裝,于-80℃冰箱保存,備用。

1.2.5 ELISA 方法檢測家兔血清β-catenin、TNF-α水平 取備用血清,ELISA 方法檢測四組家兔血清中β-catenin、TNF-α 含量,具體操作按試劑盒說明進行；用酶標儀在450 nm 測定光密度值(OD 值),以濃度作為橫坐標,吸光度值作為縱坐標,繪制標準曲線,根據標本的OD 值在坐標上找出對應的濃度值,單位用pg/ml表示。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料符合正態分布以均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齊性時用LSD 法,方差不齊時用Dunnett T3 法,組內比較采用配對t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 四組家兔改良Lequesne MG 評分比較 模型組、苗藥熏蒸組、苗藥離子導入組家兔第10、20 天的改良Lequesne MG 評分均高于正常對照組,差異有統計學意義(P＜0.01)；苗藥熏蒸組、苗藥離子導入組家兔第10、20 天的改良Lequesne MG 評分均低于模型組,差異有統計學意義(P＜0.01)；苗藥熏蒸組與苗藥離子導入組家兔第10、20 天的改良Lequesne MG 評分組間比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。正常對照組、模型組家兔第20 天的改良Lequesne MG 評分與本組第10 天比較,差異無統計學意義(P＞0.05)；苗藥熏蒸組、苗藥離子導入組家兔第20 天的改良Lequesne MG 評分均低于本組第10 天,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 四組家兔改良Lequesne MG 評分比較(±s,分)

表1 四組家兔改良Lequesne MG 評分比較(±s,分)

注：與正常對照組比較,aP＜0.01；與模型組比較,bP＜0.01；與本組第10 天比較,cP＜0.05

2.2 四組家兔血清β-catenin、TNF-α 水平比較模型組、苗藥熏蒸組、苗藥離子導入組家兔血清β-catenin、TNF-α 水平均高于正常對照組,差異有統計學意義(P＜0.01)；苗藥熏蒸組家兔血清β-catenin、TNF-α 水平均低于模型組,苗藥離子導入組家兔血清β-catenin 水平低于模型組,差異有統計學意義(P＜0.01)；苗藥離子導入組家兔血清TNF-α 水平與模型組比較,差異無統計學意義(P＞0.05)；苗藥離子導入組家兔血清β-catenin 水平與苗藥熏蒸組比較,差異無統計學意義(P＞0.05)；苗藥離子導入組家兔血清TNF-α 水平高于苗藥熏蒸組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 四組家兔血清β-catenin、TNF-α 水平比較(±s,pg/ml)

表2 四組家兔血清β-catenin、TNF-α 水平比較(±s,pg/ml)

注：與正常對照組比較,aP＜0.01；與模型組比較,bP＜0.01；與苗藥熏蒸組比較,cP＜0.05

3 討論

膝骨關節炎是一種以膝關節軟骨退行性改變為病理性特征的慢性進行性骨關節病,主要表現為關節疼痛、僵直、畸形和關節功能嚴重障礙［6］。隨著我國社會人口的老齡化,膝骨關節炎因其在老齡人中的高發病率與危害性成為人類健康的主要問題。因此,探討膝骨關節炎發病的機制以及尋找一種安全、有效、方便的防治方法,是廣大學者面臨的重大課題。

膝骨關節炎的病因及發病機制尚不完全清楚,目前認為其發病中心環節是關節軟骨的退行性改變,而Wnt/β-catenin 信號通路在軟骨細胞的生長發育、增殖、分化、遷移、調亡及穩態維持方面起著重要作用。β-catenin 是經典Wnt 信號通路的核心分子,上游分子傳遞的信號均需通過β-catenin 才能發揮作用。有研究發現膝骨關節炎患者軟骨組織中β-catenin的mRNA 表達水平均明顯增加,但在未受損傷軟骨中的表達沒有升高［7］,而Wnt/β-catenin 的過度表達以及β-catenin 的降解減少,都會引起轉錄水平升高進而導致軟骨細胞的細胞外基質合成停止［8］。膝骨關節炎關節組織、滑液中均存在促炎細胞因子,如白細胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α 等［9］。其中TNF-α 是膝骨關節炎病理改變過程中促進軟骨基質降解和關節軟骨破壞的最重要細胞因子,能誘導滑膜組織中β-catenin 等因子的分泌,從而促進滑膜炎癥的進一步發展［10］,由此說明TNF-α 可能通過Wnt/β-catenin 通路驅動膝骨關節炎炎癥反應和誘導軟骨退變。本實驗結果顯示,與正常對照組相比,模型組β-catenin、TNF-α 水平顯著升高,與上述研究結果一致,β-catenin 和TNF-α 均參與了膝骨關節炎的產生和發展。

膝骨關節炎在苗醫中當屬“風濕類疾病”中的冷骨風、冷肉風、濕熱風范疇［11］。近幾年的臨床研究表明苗藥外治法治療膝骨關節炎有明確的臨床療效,可以減輕或改善患者關節疼痛度、關節疼痛、晨僵、屈伸不利的癥狀,降低血清炎性指標血沉(ESR)、C 反應蛋白(CRP)及中醫證候積分情況［12-14］,可以對膝骨關節炎模型大鼠的痛行為及膝關節活動有明顯的改善作用,并通過促進關節軟骨bcl-2 的表達和抑制p53、Bax 的表達,從而抑制膝骨關節炎軟骨細胞的凋亡,改善軟骨的病變［15,16］。

本研究選用的苗藥驗方是貴州苗族人民在長期與膝骨關節炎抗爭的過程中發現總結的苗藥熏蒸常用方,有很高的實用價值,但受各種條件的限制,其治療的機制研究相對滯后。因此,作者在該苗藥驗方熏蒸治療廣泛的臨床應用基礎上,運用了離子導入法這種新型的經皮給藥方法,觀察苗藥驗方對膝骨關節炎模型家兔血清中β-catenin 和TNF-α 的影響,探討苗藥防治骨關節炎軟骨退變的機制。本研究發現該苗藥驗方經皮給藥能夠改善膝骨關節炎家兔模型改良Lequesne MG 評分,降低膝骨關節炎家兔模型血清中Wnt/β-catenin 通路上的核心分子β-catenin、促炎細胞因子TNF-α 的水平。初步證實了苗藥驗方經皮給藥能夠通過調控Wnt/β-catenin 通路,減輕膝骨關節炎炎癥反應,從而改善膝骨關節炎癥狀,延緩軟骨細胞的損傷,本研究為苗藥驗方經皮給藥的進一步臨床推廣應用提供了實驗依據。