熱炎寧合劑高效液相色譜指紋圖譜及其多指標成分定量分析

蘇 若，李桂女

（1.海南醫學院第二附屬醫院藥學部，海南 海口 570102；2.海南醫學院第一附屬醫院藥學部，海南 海口 570100）

熱炎寧合劑由蒲公英、虎杖、北敗醬、半枝蓮4味中藥材組方，具有清熱解毒功效，主治外感風熱、內郁化火所致風熱感冒，證見發熱、咽喉腫痛、口苦咽干、咳嗽痰黃、尿黃便結，也可用于化膿性扁桃體炎、急性咽炎、急性支氣管炎等見上述證候者。現代臨床多用其治療急性扁桃體炎［1］、小兒急性上呼吸道感染［2］、皰疹性咽峽炎［3］、小兒肺炎［4］、普通型手足口病［5］。該方收載于2020年版《中國藥典（一部）》，質量標準僅有大黃素和虎杖苷含量的限度檢測，未能反映藥品整體質量，相關文獻也主要集中在制劑中少數幾個藥效成分的定量分析［6］。為更好地反映熱炎寧合劑內在質量，完善質量標準，本研究中建立了其高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析方法，并對其主要藥效成分綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、虎杖苷、野黃芩苷、木犀草素、芹菜素和大黃素含量進行測定，為高效控制和評價熱炎寧合劑的質量提供依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：e2695 Alliance型高效液相色譜儀，包含DAD紫外檢測器（美國Waters公司）；Mettler XP6型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；BSA124S型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；KQ-250E型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

試藥：熱炎寧合劑（清華德人西安幸福制藥有限公司，批號分別為190503，190621，190724，190811，190915，

191024，191029，191125，191208，200326，200413，200714，200907，200919，201123，編號為S1～S15）；綠原酸對照品（批號為1108753-201817，含量96.8%），秦皮乙素對照品（批號為110741-201708，含量99.9%），咖啡酸對照品（批號為110885-201703，含量99.7%），虎杖苷對照品（批號為111575-201603，含量87.3%），野黃芩苷對照品（批號為110842-202010，含量91.5%），木犀草素對照品（批號為111520-202006，含量94.4%），芹菜素對照品（批號為111901-202004，含量99.4%），大黃素對照品（批號為110756-201913，含量96.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min時7%A，5～20 min時7%A→25%A，20～55 min時25%A→65%A，55～65 min時65%A，65～70 min時65%A→85%A，70～75 min時85%A→7%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：325 nm（0～55 min，綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、虎杖苷、野黃芩苷、木犀草素和芹菜素）和254 nm（55～70 min，大黃素）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含綠原酸4.22 μg、秦皮乙素7.52 μg、咖啡酸1.88 μg、虎杖苷106.49 μg、野黃芩苷15.43 μg、木犀草素10.00 μg、芹菜素4.88 μg、大黃素7.46 μg的溶液，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

供試品溶液：精密量取樣品10 mL，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇100 mL，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，置100 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，濾過，取續濾液，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜建立

2.3.1 方法學考察

精密度試驗：取樣品（編號S1）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定5次。以虎杖苷峰（S）為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果的RSD均小于3.7%（n=5），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，16，20，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定。以虎杖苷峰（S）為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間及相對峰面積。結果各特征峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于2.6%（n=6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（編號S1）適量，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。以虎杖苷峰（S）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結果的RSD均小于2.8%（n=6），表明方法重復性良好。

2.3.2 HPLC指紋圖譜的建立及共有峰指認

取15批樣品各適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。將15批樣品的色譜數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 A版）評價分析，以編號S1樣品色譜圖為參考圖譜，采用多點校正全譜匹配生成指紋圖譜共有模式，時間窗寬度設為0.1 min，見圖2。結果15批樣品中，共檢測到25個共有峰，通過與混合對照品溶液圖譜（圖3）比對，指認出其中8個共有峰，6號峰為綠原酸、7號峰為秦皮乙素、8號峰為咖啡酸、13號峰為虎杖苷、14號峰為野黃芩苷、21號峰為木犀草素、23號峰為芹菜素、24號峰為大黃素，其保留時間分別為19.69，20.43，22.22，33.39，35.71，47.63，53.92，60.18 min。以13號峰為參照峰，計算其他共有峰相對峰面積，結果見表1。

2.3.3 相似度評價

將15批樣品的色譜數據導入前述相似度評價系統，以共有模式為對照圖譜進行相似度計算。結果15批樣 品 的 相 似 度 分 別 為0.997，0.999，0.995，0.994，0.998，0.997，0.996，0.999，0.999，0.998，0.999，0.999，0.998，0.996，0.999，均大于0.99，表明熱炎寧合劑各批次制備工藝一致性較好，質量較穩定。

2.4 含量測定

2.4.1 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2項下供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中8個待測成分與相鄰色譜峰之間分離較好（分離度＞1.5），理論板數按虎杖苷峰計應大于7 000，拖尾因子＜1.05。供試品溶液色譜圖見圖4。

圖1 15批熱炎寧合劑高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 Superimposed HPLC fingerprints of 15 batches of Reyanning Mixture

圖2 熱炎寧合劑高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.2 Reference HPLC fingerprint of Reyanning Mixture

圖3 混合對照品溶液高效液相色譜圖6.Chlorogenic acid 7.Aesculetin 8.Caffeic acid 13.Polydatin 14.Scutellarin 21.Luteolin 23.Apigenin 24.EmodinFig.3 HPLC chromatogram of mixed reference solution

線性關系考察：精密量取混合對照品溶液0.5，1，2，4，6，8 mL，分別置10 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，結果見表2。

檢測限和定量限考察：精密量取混合對照品溶液適量，加70%甲醇，倍比稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）為3∶1和10∶1時的質量濃度分別記作檢測限和定量限，結果見表2。

精密度試驗：取供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果見表3，表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，4，8，16，20，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果見表3，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（編號S1）適量，精密稱定，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果見表3，表明方法重復性良好。

表1 15批熱炎寧合劑指紋圖譜共有峰相對峰面積Tab.1 Common peak relative peak areas of fingerprints of 15 batches of Reyanning Mixture

圖4 供試品溶液高效液相色譜圖6.Chlorogenic acid 7.Aesculetin 8.Caffeic acid 13.Polydatin 14.Scutellarin 21.Luteolin 23.Apigenin 24.EmodinFig.4 HPLC chromatogram of test solution

加樣回收率試驗：精密量取已知含量樣品（編號S1）5 mL，共9份，分為3組，分別精密加入每1 mL含綠原酸0.256 mg、秦皮乙素0.456 mg、咖啡酸0.150 mg、虎杖苷6.454 mg、野黃芩苷0.936 mg、木犀草素0.606 mg、芹菜素0.296 mg、大黃素0.452 mg的混合對照品溶液2，2.5，3 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表3。

表2 線性關系及檢測限、定量限考察結果Tab.2 Results of the linear relationship investigation，LOD and LOQ

2.4.2 樣品含量測定

取15批樣品適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，平行3次，記錄峰面積并計算含量，結果見表4。

表3 精密度、穩定性、重復性及加樣回收試驗結果Tab.3 Results of the precision，stability，repeatability tests and the recovery test

表4 15批熱炎寧合劑中8個成分含量測定結果（mg/mL，n=3）Tab.4 Results of content determination of eight components in batches of Reyanning Mixture（mg/mL，n=3）

3 討論

3.1 指標成分

熱炎寧合劑能有效改善人型冠狀病毒肺炎病毒襲肺證模型小鼠的各項指標［7-9］。其于2020年2月1日入選《陜西省新冠病毒感染的肺炎中醫藥治療方案（試行第二版）》［10］，作為預防和治療新型冠狀病毒肺炎輕、重癥用藥。方中蒲公英味苦、甘，性寒，苦以降泄，甘以解毒，寒能清熱兼散滯氣，為清熱解毒、消癰散結之佳品，以綠原酸、咖啡酸等酚酸類及芹菜素、木犀草素等黃酮類成分為主要活性成分［11］；虎杖清熱解毒，降泄肝膽濕熱，瀉下通便，以虎杖苷為代表的二苯乙烯類及以大黃素為代表的蒽醌類是其主要藥效成分［12］；敗醬草清熱解毒、消癰排膿、祛瘀止痛，以秦皮乙素為代表的香豆素類及芹菜素、木犀草素等黃酮類成分為主要活性成分［13］；半枝蓮清熱解毒、利水消腫，黃芩能清熱燥濕和瀉火解毒，以野黃芩苷為代表的黃酮類成分為其主要藥效成分［14］。因此本研究中選擇上述8個成分作為熱炎寧合劑的定量分析指標。

3.2 檢測波長選擇

本研究中采用DAD檢測器全波長掃描樣品溶液，結果綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、虎杖苷、野黃芩苷、木犀草素、芹菜素的最大吸收波長分別為325，323，232，306，335，349，338 nm，大黃素最大吸收波長為254 nm，以指紋圖譜基線平穩、色譜峰較多，各色譜峰間分離效果好為指標，使用儀器固定波長變換程序功能經多次試驗確定采用325，254 nm分段波長法作為樣品指紋圖譜和8個有效成分含量測定的采集波長。

3.3 色譜條件

在流動相選擇時，重點比較了乙腈-水溶液（添加不同比例磷酸）、甲醇-水溶液（添加不同比例磷酸）對指紋圖譜和8個成分含量測定的影響。結果發現，乙腈-0.05%磷酸水溶液作為流動相系統時洗脫效果較好；同時比較了不同流速（0.8，1.0，1.2，1.5 mL/min）、不同體積流量（5，10，20 μL）及不同柱溫（20，25，30，35℃）對試驗結果的影響，結果發現，流速1.0 mL/min、進樣量10 μL、柱溫30℃為最佳條件。

3.4 樣品提取方法

本研究中分別考察了不同比例甲醇水溶液和乙醇水溶液作為提取溶劑，超聲和加熱回流兩種提取方法，以及不同提取時間（30，45，60 min）對8個指標成分和指紋圖譜的影響。結果發現，70%甲醇溶液超聲處理30 min為最佳提取方法。

3.5 含量測定結果分析

2020年版《中國藥典（一部）》規定熱炎寧合劑“每1 mL含虎杖以大黃素計，不得少于0.15 mg”“每1 mL含虎杖以虎杖苷計，不得少于0.35 mg”，本研究中15批樣品大黃素含量為0.214～0.236 mg/mL，虎杖苷含量為3.206～3.316 mg/mL，均符合限量標準。

綜上所述，本研究中建立了熱炎寧合劑HPLC法指紋圖譜及8個有效成分定量分析方法，精密度、重復性、穩定性均良好，能系統評價制劑質量，實現多成分同時定量分析。