復方金線蓮口服液水提工藝優化及薄層色譜鑒別*

李 景，黃德福

（福建醫科大學孟超肝膽醫院藥學部，福建 福州 350025）

復方金線蓮口服液具有清熱解毒、益氣涼血功效，臨床對急慢性肝炎、乙型肝炎病毒攜帶者熱毒氣虛證有良好療效。其由金線蓮與靈芝組方，兩者均含有大量多糖。早期復方金線蓮口服液為靈芝水提濃縮液與金線蓮鮮草榨汁液經過濾混合、配制、灌裝等步驟制成。但在實際生產過程中，金線蓮鮮草清洗晾干后榨汁，晾干程度不同，導致榨汁量相差較大，最終造成藥品批間穩定性差，且殘留大量多糖。水能將多糖提取完全，根據復方中兩味藥材活性成分和中醫藥臨床用藥習慣，將金線蓮鮮草與靈芝一起水煎煮，提取濃縮，簡化工藝。本研究中在單因素考察結果的基礎上，以總多糖含量為評價指標，采用正交試驗法優選復方金線蓮口服液的提取工藝，為后期申報工藝變更及生產提供試驗依據，同時對制劑中的金線蓮和靈芝進行薄層色譜（TLC）鑒別，進一步優化質量控制方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

L5S型紫外-可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；ZF-20D型暗箱式紫外線分析儀（上海耀壯檢測儀器設備有限公司）；HH-4型數顯恒溫水浴鍋（拓赫機電科技上海有限公司）；XS205型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

金線蓮對照藥材（北京中科質檢生物有限公司，批號為200815）；D-無水葡萄糖對照品（批號為110833-201908，含量99.8%）、靈芝對照藥材（批號為120968-201809），均購自中國食品藥品檢定研究院；復方金線蓮口服液（醫院自制，批號為20210602，規格為每瓶10 mL）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 總多糖含量測定

2.1.1 溶液制備

取D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）溶解，制成質量濃度為107 μg/mL的對照品溶液。精密移取樣品提取原液3 mL，置50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得供試品溶液。以水作空白對照溶液。

2.1.2 試驗條件

取對照品溶液1.5 mL，置具塞試管中，分別加入0.2%新鮮配制的蒽酮硫酸溶液6 mL，搖勻，于沸水浴中加熱20 min，取出，立即在冰水浴中放冷15 min。取適量，于400～700 nm波長范圍內進行掃描，測得其在620 nm波長處有最大吸收，故選擇620 nm作為檢測波長［1-4］。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密移取對照品溶液0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL于試管中，加水稀釋至2 mL，按2.1.2項下試驗條件進樣測定。記錄吸光度（OD）值。以OD值（A）為縱坐標、D-無水葡萄糖對照品質量濃度（C，mg/mL）為橫坐標進行線性回歸。得回歸方程A=8.756 2C+0.048 4（r=0.999 3）。結果表明，葡萄糖質量濃度在32.1～85.6 μg/mL范圍內與OD值線性關系良好。

檢測限和定量限考察：以響應值偏差/標準曲線斜率（δ/S，δ=0.002 3，S=8.756 2）的3.3倍和10倍時的質量濃度分別為檢測限和定量限。結果檢測限為0.87 μg/mL，定量限為2.63 μg/mL。

精密度試驗：精密移取對照品溶液0.8 mL，按

2.1.2 項下試驗條件連續進樣測定6次（n=6），同時，連續測定3 d，記錄OD值。結果日內精密度的RSD為0.12%（n=6），日間精密度的RSD為1.26%（n=3），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一份供試品溶液，分別在室溫下放置0，20，40，60，80，100，120 min時，按2.1.2項下試驗條件進樣測定，記錄OD值。結果的RSD為1.56%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置120 min內基本穩定。

重復性試驗：取同一份樣品提取原液3 mL，共6份，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，按2.1.2項下試驗條件進樣測定，記錄OD值，并計算總多糖含量。結果總多糖平均含量為6.28 mg/mL，RSD為1.63%（n=6）。表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批已知含量樣品提取原液0.01 mL，共6份，分別加入對照品溶液適量，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，按2.1.2項下試驗條件進樣測定，記錄OD值并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2 提取工藝優選

2.2.1 單因素試驗

加水量：按制劑處方配比稱取，共5份，分別加入5，10，15，20，25倍量水，煎煮1.5 h，提取2次，按2.1.2項下試驗條件進樣測定，記錄OD值，并計算總多糖含量。結果分別為2.94，3.92，4.38，6.45，5.27 mg/mL，可見，加水量在5～20倍時，總多糖含量逐漸升高，當超20倍量后總多糖含量趨于平緩，故選擇加水量15，20，25倍量作為三水平。

煎煮時間：按制劑處方配比稱取，共5份，分別加20倍量水，煎煮0.5，1，1.5，2，2.5 h，提取2次，按2.1.2項下試驗條件進樣測定，記錄OD值，并計算總多糖含量。結果分別為1.97，4.84，6.56，5.75，5.68 mg/mL。可見，煎煮時間在0.5～1.5 h時，總多糖含量逐漸升高，當超1.5 h后總多糖含量趨于平緩，故選擇煎煮時間1，1.5，2 h作為三水平。

提取次數：按制劑處方配比稱取，共5份，分別加20倍量水，煎煮1.5 h，提取1，2，3，4，5次，按2.1.2項下試驗條件進樣測定，記錄OD值，并計算總多糖含量。結果分別為5.28，6.59，6.58，6.29，6.23 mg/mL，可見，提取次數在1～2次時，總多糖含量逐漸升高，超2次后趨于平緩，故選擇提取次數1，2，3次作為三水平。

2.2.2 正交試驗方法與結果

根據單因素考察結果，以加水量（因素A）、煎煮時間（因素B）和提取次數（因素C）為考察因素，總多糖含量為評價指標，采用L9（34）正交試驗法優選復方金錢蓮口服液水提工藝［5-6］。因素與水平見表2，正交試驗設計與結果見表3，方差分析結果見表4。

由表3可知，各因素對總多糖提取效果的影響為A＞B＞C，即加水量＞煎煮時間＞提取次數，結合各因素K值大小，初步選取的提取條件為A2B2C3。由表4可知，因素A、因素B對提取效果有顯著影響（P＜0.05），從實際生產角度，考慮能耗成本和生產周期，最終選擇提取工藝為A2B2C2，即加20倍量水，每次煎煮1.5 h，提取2次。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and their levels

表3 正交試驗設計及結果Tab.3 Design and results of the orthogonal test

表4 方差分析結果Tab.4 Results of the ANOVA

2.2.3 驗證試驗

按處方量稱取藥材，共3份，按最佳水提工藝提取。結果總多糖含量分別為6.48、6.59，6.63 mg/mL，平均6.57 mg/mL，RSD為1.18%。表明優選出的工藝科學、穩定可靠，可用于復方金線蓮口服液的提取制備。

2.3 TLC鑒別

2.3.1 金線蓮

取制劑（批號20210602）100 mL，加入三氯甲烷振搖提取2次，每次25 mL，合并上層水溶液，濃縮蒸干，加甲醇2 mL超聲溶解，得供試品溶液。取金線蓮對照藥材2 g，加水500 mL煎煮30 min，濾過，濾液濃縮至100 mL，并按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按復方金線蓮口服液處方及制備工藝制備缺金線蓮的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成缺金線蓮陰性對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502［7］，精密吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-乙酸（85∶13∶2，V/V/V）為展開劑，展開，晾干，噴以新配制的2% 3，5-二硝酸基苯甲酸乙醇溶液，再噴以5%氫氧化鉀乙醇溶液。置日光燈下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上，顯相同顏色斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖1.Test solution 2.Reference medicinal material solution 3.Negative reference solutionA.Nelumbo roxburghii B.Ganoderma lucidumFig.1 TLC chromatograms

2.3.2 靈芝

取制劑（批號20210602）100 mL，加入乙酸乙酯50 mL，加熱回流60 min，放冷，轉移至分液漏斗中，靜置分層，取上層乙酸乙酯，濃縮蒸干，加甲醇2 mL超聲溶解，得供試品溶液。取靈芝對照藥材3 g，加水500 mL煎煮30 min，濾過，濾液濃縮至100 mL，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。按復方金線蓮口服液處方及制備工藝制備缺靈芝的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成缺靈芝的陰性對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法［7］，精密吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上層溶液為展開劑，展開，晾干，在置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材色譜相應位置上顯相同顏色熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

3 討論

3.1 評價指標選擇

復方金錢蓮口服液由金線蓮與靈芝兩味中藥組方，金線蓮為閩臺珍稀藥用植物，具有清熱涼血及解毒功效，為方中君藥，其主要藥理活性成分為多糖及糖苷類［8-11］。臣藥靈芝有補氣安神、止咳平喘功效，主要有效成分為多糖、三萜及甾醇類［12-14］，其中多糖含量為2020年版《中國藥典（一部）》中靈芝的質量評價指標之一。金線蓮、靈芝多糖均對肝損傷有較好的預防和保護作用［15-22］，這與本制劑適應證吻合，故選擇總多糖含量作為該制劑提取工藝優化的評價指標。

3.2 總多糖含量測定方法選擇

總多糖含量測定常用的方法有硫酸-苯酚法與蒽酮-硫酸法等［23-25］，預試驗中同時采用2種方法對制劑總多糖含量進行測定，結果發現采用硫酸-苯酚法測定時結果數值波動較大，穩定性差。故最終采用2020年版《中國藥典（一部）》中靈芝含量測定項下蒽酮-硫酸法。

3.3 沸水浴時間選擇

采用蒽酮-硫酸法測定制劑中總多糖含量時，考察不同沸水浴時間（10，15，20，25，30 min）對最大吸收波長的影響。結果沸水浴時間為20 min時，樣品與對照品的最大吸收峰均可出現在620 nm檢測波長處。故選擇沸水浴加熱顯色20 min。

3.4 試驗方法選擇

單因素試驗的試驗次數多，成本高，周期長，且所篩選出的最優提取工藝條件僅是各單因素最優條件的集合，并未考慮各因素之間交互作用及影響程度。正交試驗是研究多因素多水平試驗的重要方法，能分析出因素間的相互關系，各因素的影響順序及程度，能減少試驗次數，并最大程度減少試驗誤差，達到高效、快速、經濟的目的。本試驗中先通過單因素試驗，確定了加水量、煎煮時間、提取次數3因素及水平。基于單因素考察結果，進行正交試驗，進一步確認各因素對總多糖提取工藝的影響順序為加水量＞煎煮時間＞提取次數，并分析得出加水量、煎煮時間對其有顯著影響。確定的最佳提取工藝為加20倍量水，每次煎煮1.5 h，提取2次，經驗證，該方法穩定可行。