桐葉飲片質量標準提升研究*

申 欣，唐 勇，查婭妮，劉 譯，丁 野

（1.湖南省懷化市食品藥品檢驗所，湖南 懷化 418000；2.湖南省食品藥品檢驗研究院，湖南 長沙 410001）

桐葉為玄參科植物白花泡桐Paulownia fortunei（Seem.）Hemsl.的干燥葉，具有清熱解毒、止血消腫功效，用于治療癰疽、疔瘡、燒燙傷、創傷出血。此前，該飲片質量標準僅有性狀項與鑒別項，為有效提升桐葉飲片質量標準，參考《湖南省中藥材標準（2009年版）》［1］中桐葉藥材的檢驗項目進行了桐葉飲片質量標準的修訂。本研究中建立了定性鑒別齊墩果酸、熊果酸的薄層色譜（TLC）法，以及同時測定齊墩果酸、熊果酸含量的高效液相色譜（HPLC）法［2-3］，同時對飲片常用的檢查項和浸出物項進行分析，為完善桐葉飲片質量標準提供依據?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20ATVP型高效液相色譜儀，包括LC-20AT型四元泵、SPD-M20A型檢測器、SIL-20A型自動進樣器、LCsolution色譜工作站（日本Shimadzu公司）；SK3300H型超聲波清洗器（上?？茖С晝x有限公司）；BX61型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；202-1A型恒溫干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；XSE105DU型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

熊果酸對照品（批號為110742-201823，含量99.9%）、齊墩果酸對照品（批號為110709-201808，含量91.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；桐葉對照藥材（湖南懷化龍成中藥飲片有限責任公司，批號為20201112），桐葉飲片（湘西宏成制藥有限責任公司，批號分別為20190823，20190801，20200828），均經湖南省懷化市食品藥品檢驗所唐勇主任中藥師鑒定為正品；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

飲片粉末呈黃綠色。非腺毛有2種：一種為星狀毛，體部4～15個細胞，呈輻射狀排列成一輪或上、下兩輪，長120～300 μm；柄部1～3個細胞。一種為單細胞，壁薄，長120～150 μm。腺毛有2種：一種為單細胞頭和單細胞柄，一種為單細胞頭和多細胞柄，頭部直徑均為20～25 μm，柄部長40～80 μm。草酸鈣簇晶呈星芒狀，存在于葉肉組織中，直徑5～10 μm。草酸鈣方晶存在于葉脈薄壁細胞內，直徑10～20 μm。螺紋導管多見，直徑10～20 μm。詳見圖1。

2.2 水分、總灰分、浸出物檢查

按2020年版《中國藥典（四部）》通則對3批藥材樣品進行水分、總灰分、浸出物測定。結果3批藥材樣品的平均水分含量為8.85%，總灰分含量為5.59%，水溶性溶出物含量為32.52%。

2.3 TLC鑒別

取藥材樣品粉末2 g，加乙醚30 mL，超聲（功率250 W，頻率50 kHz，下同）處理30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加無水乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。取熊果酸對照品、齊墩果酸對照品各適量，加乙酸乙酯制成每1 mL含2種對照品各1 mg的混合對照品溶液。取桐葉對照藥材2 g，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。精密吸取上述溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，將點樣一端浸入1%碘-二氯甲烷溶液中12～15 mm，浸過后迅速取出，立即覆以玻璃板，30 min后取下玻璃板，熱風吹2～3 min，揮去薄層板上殘留的溶液。以環己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（22∶2∶8∶0.5，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，110℃加熱至斑點顯色清晰，分別置日光燈和紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜和對照品溶液色譜相應位置上，分別顯相同顏色的斑點或熒光斑點。詳見圖2。

圖1 顯微特征圖A.Nonglandular-stellate hair B.Nonglandular hairs-unicellular C.Glandular hairs-unicellular stalk D.Glandular hairs-multicellular stalks E.Calcium oxalate clusters F.Calcium oxalate square crystal G.Catheter-threadFig.1 Microscopic characteristics

圖2 薄層色譜圖1-3.Test solution（batch numbers：20190823，20190801 20200828）4，7.Mixed reference solution 5-6.Reference medicinal materials solution A.Fluorescent lamp B.Ultraviolet lamp（365 nm）Fig.2 TLC chromatograms

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-0.1 mol/L乙酸銨溶液（67∶10∶23，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

2.4.2 溶液制備

混合對照品溶液：取齊墩果酸對照品10.32 mg、熊果酸對照品10.20 mg，精密稱定，分別置20 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容，搖勻，即得單一對照品貯備液。分別精密量取上述熊果酸、齊墩果酸單一對照品貯備液3 mL、1 mL，置同一10 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取藥材樣品粗粉0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質量，用乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4.3 方法學考察

系統適用性試驗：分別取上述混合對照品溶液和供試品溶液各20 μL，按2.4.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖3。供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液相應位置有吸收峰，各組分之間分離（分離度＞1.5）良好。

線性關系考察：分別吸取齊墩果酸對照品貯備液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，5.0 mL，熊果酸對照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。精密吸取20 μL，分別按2.4.1項下色譜條件進樣測定。以進樣量（X，ng）為橫坐標、峰面積積分值（Y）為縱坐標進行線性回歸?；貧w方程分別為Y1=324.0785X1-3537.7847（r=0.9994），Y2=283.9127X2-20 322.928 8（r=0.999 7）。結果表明，齊墩果酸和熊果酸進樣量分別在235.038～4 700.76 ng和509.490～5 094.90 ng范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

圖3 高效液相色譜圖1.Oleanolic acid 2.Ursolic acidA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.3 HPLC chromatograms

檢測限和定量限考察：取2.4.2項下單一對照品貯備液適量，倍比稀釋，按2.4.1項下色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）為3∶1和10∶1時的進樣量分別記作檢測限和定量限。結果齊墩果酸的檢測限和定量限分別為928.8 ng和1 393.2 ng，熊果酸分別為765.0 ng和1 224.0 ng。

精密度試驗：取同一供試品溶液適量，按2.4.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果齊墩果和熊果酸峰面積的RSD分別為0.68%和0.18%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，6，12，24 h后，按2.4.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為0.57%和0.28%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取藥材樣品（批號為202008282）適量，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，平行6份，按

2.4.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果齊墩果酸和熊果酸的平均含量分別為0.287 9 mg/g和0.909 6 mg/g，RSD分別為1.99%和1.08%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一藥材樣品（批號為20200828）約0.4 g，精密稱定，共6份，分別置錐形瓶中，均精密加入混合對照品溶液1 mL，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，按2.4.1項下色譜條件進樣測定，并計算加樣回收率。結果見表1（A為齊墩果酸，B為熊果酸）。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4.4 耐用性試驗

取同一批藥材樣品適量，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，分別使用兩個不同的色譜柱［LC-20AT型Shim-pack VP-ODS柱（日本Shimadzu公司，250 mm×4.6 mm，5 μm）和LC-20AT型Luna C18柱（天津博納艾杰爾科技有限公司，250 mm×4.6 mm，5 μm）］，按

2.4.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果兩種色譜柱測得齊墩果酸含量分別為0.29%和0.28%，相對偏差為1.75%；熊果酸含量分別為0.88%和0.87%，相對偏差為0.57%，表明色譜柱發生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

2.4.5 樣品含量測定

取3批藥材樣品適量，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，再按2.4.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果批號為20190823，20190801，20200828的藥材樣品中，齊墩果酸含量分別為0.19%，0.36%，0.29%（平均0.28%），熊果酸含量分別為0.54%，1.08%，0.88%（平均0.83%）。

3 討論

3.1 TLC展開方法改進

通過預試驗驗證，原標準中樣品與熊果酸對照品相應位置上所顯斑點實際為熊果酸與齊墩果酸的混合斑點。參考文獻［1，4］，改用薄層原位預處理-TLC法，經1%碘-二氯甲烷溶液處理，并在3種展開劑［環己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（10∶3∶0.5，V/V/V）、環己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20∶5∶8∶0.1，V/V/V/V）、環己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（22∶2∶8∶0.5，V/V/V/V）之間進行選擇，結果最后一種展開劑展開效果最好，齊墩果酸的比移（Rf）值為0.63，熊果酸的Rf值為0.56，實現了兩者的有效分離。

3.2 含量測定條件探索

根據文獻［5-13］對藥材樣品中齊墩果酸、熊果酸的含量測定方法，選擇乙醇為溶劑，對提取方法（回流和超聲方法）進行了對比，超聲方法簡單易行且提取率高，故選擇超聲提取，并且對超聲時間進行了20，30，40 min的考察，30 min時提取率最高，此后提取含量不再增加，故超聲提取時間定為30 min。

3.3 性狀鑒別和其他檢查項目

在性狀鑒別中，發現飲片的“葉脈于下表面突出”這一鑒別特征非常明顯，顯微鑒別螺紋導管多見。這些特征一并納入標準制訂中。