靈芝孢子類產品對模型小鼠肝損傷的改善作用*

袁抒捷，張靜，崔馨戈，祝朋玲，李思雨，周俊，張正高，彭燦，4，5，6，7△

（1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽祥云谷現代中藥有限公司，安徽 宣城 242600；3.安徽黃山云樂靈芝有限公司，安徽 宣城 242600；4.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；5.中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；6.省部共建安徽道地中藥材品質提升協同創新中心，安徽 合肥 230012；7.安徽省中醫藥研究院中藥資源保護與開發研究所，安徽 合肥 230012）

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.exFr.）Karst.或紫芝Ganodorma sinenseZhao，Xu et Zhang的干燥子實體，始載于《神農本草經》，列為上品，藥用歷史悠久［1］，有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫、抗炎、降血糖、神經保護和保肝［2-5］等藥理作用。靈芝孢子粉是靈芝的生殖細胞，不但保留了藥材的全部遺傳物質，且功效更佳［6］。靈芝孢子具有堅硬的雙壁結構［7］，一般物理方法很難破壁，使得壁內有效物質不易被消化，于是市場上出現了破壁孢子粉、富硒破壁孢子粉、孢子油等產品。本研究中以靈芝孢子類產品作用于肝損傷模型小鼠，觀察對其血清生化指標及肝組織氧化應激指標的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：TG16-WS型離心機（常州市萬豐儀器制造有限公司）；BT25S型十萬分之一電子天平（賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司）；RM2135型切片機（德國Leica公司）；BX53型顯微鏡（日本Olympus公司）；YB-7B型石蠟包埋機（孝感市亞光醫用電子技術有限公司）；RT-6000型酶標儀（雷杜生命科學股份有限公司）。

試藥：未破壁靈芝孢子粉（批號為20191027，規格為每袋250 g）、破壁靈芝孢子粉（批號為20191027，規格為每袋250 g）、富硒破壁靈芝孢子粉（批號為20191027，規格為每袋250 g）、靈芝孢子油（批號為20201031，規格為每粒0.5 g），均購自安徽黃山云樂靈芝有限公司；刀豆蛋白A（ConA，阿拉丁試劑＜上海＞有限公司，批號為39076）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（批號為20210719）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒（批號為20210402）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號為20210620）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為20210514），均購自南京建成生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號為GR2021-08）、γ干擾素（IFN-γ）ELISA試劑盒（批號為GR2021-08），均購于武漢基因美生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE，武漢賽維爾生物科技有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，佛山市日特化工有限公司）；硫酸鋁、碘酸鈉、冰醋酸、中性樹膠、二甲苯，均購于沈陽化學試劑廠。

動物：健康SPF級KM小鼠，雄性，6～8周齡，體質量30～45 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，動物實驗生產許可證號SCXK（皖）2017-001。于室溫（23±2）℃、相對濕度50%～60%、12 h光照循環的條件下飼養小鼠。動物實驗研究均經動物倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模及給藥

將42只小鼠隨機分為空白對照組（等體積0.5%CMC-Na）、模型組（等體積0.5% CMC-Na）、未破壁靈芝孢子粉組（未破壁組，0.1 g/kg）、破壁靈芝孢子粉組（破壁組，0.1 g/kg）、富硒破壁靈芝孢子粉組（富硒破壁組，0.1 g/kg）、靈芝孢子油組（孢子油組，0.1 g/kg），各7只。均尾靜脈注射0.25 mg/mL Con A，以復制肝損傷小鼠模型；空白對照組給予等體積生理鹽水，隔天1次，連續2周。建模成功后各組灌胃相應藥物或0.5%CMC-Na，每天1次，連續30 d。

1.2.2 觀察指標

肝組織形態學：末次給藥后禁食不禁飲12 h，小鼠眼球取血，處死，取出肝臟，生理鹽水清洗，擦去血液，濾紙吸干水分。在肝右葉同一部位，摘取部分肝組織，以4 %多聚甲醛固定，脫水透明、包埋、切片、脫蠟，HE染色，光學顯微鏡下觀察小鼠肝組織形態學變化。

血清生化指標：取上述小鼠血液，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，取上清。按相應試劑盒說明書方法測定血清中AST，ALT，TNF-α，IFN-γ的水平。

肝組織氧化應激指標：取上述小鼠肝臟，以冰冷生理鹽水洗凈，擦去血液，用濾紙拭干。取0.2 g肝組織于組織勻漿管中，加600 μL生理鹽水，3 000 r/min離心15 min，取上清。按相應試劑盒說明書方法操作，以硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 肝組織形態學

空白對照組小鼠肝細胞形態正常，核大而圓，居中，肝索呈規范的放射狀排列，肝小葉結構完整；模型組小鼠肝細胞呈明顯點灶狀壞死，壞死灶處伴炎性細胞浸潤，且肝竇有大量的紅細胞堆積，肝索排列不規則，肝小葉形態不清晰。與模型組比較，破壁組、富硒破壁組、孢子油組小鼠肝細胞壞死程度均明顯減輕，肝索排列較規范，炎性程度減輕；未破壁組小鼠肝細胞壞死程度雖減輕，但壞死處仍有炎性細胞浸潤。詳見圖1。

圖1 肝組織形態學（HE，×200）A.Blank control group B.Model group C.Wall-broken group D.Selenium-enriched wall-broken group E.GLS oil group F.Wall-unbroken groupFig.1 Histomorphology of liver tissue（HE，×200）

2.2 血清生化指標

與空白對照組比較，模型組小鼠血清中AST，ALT，TNF-α，IFN-γ水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，破壁組、富硒破壁組、孢子油組、未破壁組小鼠血清中AST，ALT，TNF-α，IFN-γ水平均顯著降低（P＜0.05）；后4組間4個指標差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.3 肝組織氧化應激指標

與空白對照組比較，模型組小鼠肝組織中SOD水平顯著降低，MDA水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，破壁組、富硒破壁組、孢子油組、未破壁組小鼠肝組織中SOD水平均顯著升高，MDA水平均顯著降低（P＜0.05）；后4組間2個指標差異無統 計 學意義（P＞0.05）。詳見表2。

表1 各組小鼠血清生化指標比較（±s，n=7）Tab.1 Comparison of serum biochemical indexes of mice in each group（±s，n=7）

表1 各組小鼠血清生化指標比較（±s，n=7）Tab.1 Comparison of serum biochemical indexes of mice in each group（±s，n=7）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。表2同。Note：Compared with those in the blank control group，*P＜0.05；Compared with those in the model group，#P＜0.05（for Tab.1-2）.

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表2 各組小鼠肝組織中SOD及MDA水平比較（±s，n=7）Tab.2 Comparison of SOD and MDA levels in liver tissues of mice in each group（±s，n=7）

表2 各組小鼠肝組織中SOD及MDA水平比較（±s，n=7）Tab.2 Comparison of SOD and MDA levels in liver tissues of mice in each group（±s，n=7）

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3 討論

有研究表明，ConA與肝竇內皮細胞和特殊肝巨噬細胞（Kupffer細胞）上富含甘露糖的糖蛋白結合，同時交聯T淋巴細胞受體而激活T淋巴細胞，而后分泌細胞因子TNF-α及IFN-γ等，從而誘導肝竇內皮細胞和肝細胞的凋亡［8］，該發病機制與人急性肝炎有一定相似［9］。以ConA建模可確定劑量，過程更易標準化，故目前臨床常用其復制急性免疫介導性肝炎模型［10］。

ConA對肝細胞造成損傷時，肝細胞膜通透性增大，導致肝細胞內的AST及ALT進入血液，增加血液中的含量，故可認為當血液中AST，ALT水平異常升高時，肝臟組織已發生了急性損傷［11］。肝臟發生急性損傷時，肝小葉出現大量炎性細胞浸潤，肝臟門管附近主要被CD4+T淋巴細胞浸潤［12］，隨后Th1型細胞因子［如TNF-α，IFN-γ和白細胞介素（IL）-2］被大量釋放［13］。其中，IFN-γ和TNF-α是誘導T淋巴細胞依賴性肝損傷中肝細胞凋亡和肝纖維化的關鍵細胞因子［14］。李小剛等［15］研究發現，抗TNF-α單抗可以阻斷ConA性肝損傷的發生。FENG等［14］用IL-37持續性抑制IFN-γ和TNF-α的產生，達到抑制自身免疫性肝炎等T淋巴細胞依賴性肝損傷的發展。此外，肝臟細胞損傷，出現氧化應激，產生的超氧離子需消耗大量的SOD，以減少對機體的損害，此過程會表現為機體SOD水平的降低；產生的MDA會加重細胞的腫脹破損，反映組織的過氧化程度加重［16］。本研究中，與模型組比較，用藥組小鼠血清中AST，ALT，TNF-α，IFN-γ水平及肝組織中MDA水平均顯著降低，肝組織中SOD水平均顯著升高。

綜上所述，4種靈芝孢子類產品對模型小鼠肝損傷均有一定改善作用，其作用機制可能與修復損傷肝細胞、促進肝細胞生長、抗氧化和免疫調節有關。但未破壁孢子粉的療效要次于其他3種產品，可能因為由纖維素、木質素等高分子有機物和硅、鈣等無機元素構成的堅硬雙壁結構妨礙了有效成分的吸收。