人參根飲液對模型鼠骨質疏松的改善作用*

張喜武，張 利，王雅泓，李夢聰，胡志欣，王璐璇，王 銳，竇金金

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱成程生命與物質研究所，黑龍江 哈爾濱 150500；3.黑龍江中醫藥大學第一附屬醫院，黑龍江 哈爾濱 150040）

骨質疏松癥（OP）屬常見慢性骨疾病，是以骨代謝紊亂、微結構損壞、骨量流失、骨密度和鈣（Ca）水平降低為特點，易發生脆性骨折的全身骨代謝疾病［1-4］。30歲以后機體內骨量約以1%的幅度逐年遞減，人們在生活中不良的生活習慣，如酗酒、吸煙、運動量不足等均會造成骨質流失，導致繼發性OP，同時疾病、藥物等多個因素也易導致OP［5］。人參為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，味甘，性溫，是我國傳統的滋補養生名貴藥材。人參主補五臟，現代藥理學研究證實，可隨機體機能狀態的不同發揮雙向作用，即適應原樣作用，同時也證實人參皂苷類成分對OP有潛在的防治作用。人參皂苷Rb1通過上調RUNX2蛋白表達、調節Wnt/β-catenin信號通路、護骨素（OPG）、核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的表達和抑制P21和P27mRNA的表達來促進成骨分化［6-7］。人參碳量子點溶膠液（簡稱人參根飲液）是以人參為原料，采用超音速對撞粉碎和光電碳化技術，使其碳化集聚負載大量電荷［8］而成的溶液。本研究中擬探討人參根飲液對模型鼠骨質疏松的改善作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：AL204型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Synergy H1型酶標儀（美國BioTek公司）；TGL-16C型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；OSTEOCORE型雙能X光骨密度儀（法國DMS公司）；生物碳原子團簇活化裝置（黑龍江沃生控股有限公司）；ASP300S型脫水機、HI1210型攤片機、RM2255型切片機、EG1150H型包埋機（德國Leica公司）；Nikon E600W型熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；RT-9200型半自動生化分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）。

試藥：人參根飲液（哈爾濱團簇現代中醫健康服務有限公司，批號201811190802，規格每瓶95 mL）；維A酸（上海麥克林生化科技有限公司，批號為C12056221）；水合氯醛（天津市凱通化學試劑有限公司，批號為20201109）；4%多聚甲醛（批號為0104A21），脫鈣液（批號為0104A21），均購自北京雷根生物技術有限公司；小鼠血清骨鈣素（BGP）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號為E20210105A），小鼠堿性磷酸酶（ALP）ELISA試劑盒（批號為E20201217A），均購自美國R&D公司。

動物：SPF級KM小鼠50只，雌性，體質量（20±2）g；SD大鼠40只，雄性，體質量（200±20）g，均購自黑龍江中醫藥大學藥物安全評價中心，動物生產合格證號SCXK（黑）2018-003。實驗期間所有動物分籠飼養在室溫恒定、相對濕度適度、通風良好的清潔環境中，飼養條件均一致，自由飲用水，以專用鼠糧喂養，每周更換墊料2次，均于飼養室適應性喂養1周。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模及給藥

將50只小鼠隨機分為空白對照組（等體積純凈水），模型組（等體積純凈水），人參根飲液高、低劑量組（9.88 mL/kg和4.94 mL/kg），人參根飲液預防1組（4.94 mL/kg）［8］，各10只。灌胃維A酸70 mg/kg，每天1次，連續14 d以復制骨質疏松小鼠模型。建模成功后前4組灌胃相應藥物或純凈水，每天1次，連續28 d；人參根飲液預防1組灌胃相應藥物，每天1次，連續28 d后灌胃維A酸70 mg/kg，每天1次，連續14 d，同時灌胃相應藥物。

將40只大鼠隨機分為空白對照組（等體積純凈水）、模型組（等體積純凈水）、人參根飲液組（6.62 mL/kg）、人參根飲液預防2組（3.31 mL/kg）［8］，各10只。灌胃維A酸70 mg/kg，1 d 1次，連續14 d以復制骨質疏松大鼠模型［9］。建模成功后前3組灌胃相應藥物或純凈水，1 d 1次，連續28 d。人參根飲液預防2組灌胃相應藥物，1 d 1次，共42 d，連續28 d后灌胃維A酸46 mg/kg，每天1次，連續14 d。

1.2.2 觀察指標

一般情況：觀察各組小鼠食少、豎毛、喜臥、體質量減輕等表現［10］。

血清學指標：于末次給藥24 h后，小鼠摘眼球取血，室溫下靜置2 h，以離心半徑6 cm、3 000 r/min離心15 min，吸取上清液，以半自動生化儀檢測血清Ca、磷（P）水平，酶標儀檢測ALP和BGP水平，參照試劑盒說明書操作。

臟器指數：稱定小鼠體質量，于取血后解剖取其脾、胸腺、子宮，稱定質量，并計算臟器指數。臟器指數=臟器質量（g）/體質量（g）×1 000。

骨組織形態學：于小鼠取血后，取其左側股骨，以生理鹽水清洗，置4%多聚甲醛中固定；常溫下進行乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液脫鈣，每日檢查股骨的脫鈣情況，以針頭能插入股骨表面為脫鈣成功。將脫鈣后的股骨取出，流水過夜沖洗，脫水，石蠟包埋，切片（厚度6 μm），蘇木素-伊紅（HE）染色，切片，顯微鏡下觀察骨組織形態并拍照。

骨密度：于末次給藥后，大鼠腹腔注射水合氯醛（35 mg/kg），以骨密度儀測定大鼠股骨的骨密度值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 小鼠一般情況

人參根飲液高劑量組、預防1組各死亡1只小鼠。空白對照組小鼠精神狀態良好，日常活潑好動，飲食正常；模型組小鼠精神狀態較差，皮毛粗糙，喜臥，飲食減少。與模型組比較，人參根飲液高、低劑量組和預防1組小鼠精神狀態良好，皮毛較光滑，活動較靈敏。小鼠體質量變化見圖1。

圖1 小鼠體質量變化曲線Fig.1 Change profiles of body mass of mice

2.2 小鼠臟器指數

與空白對照組比較，模型組小鼠脾指數顯著升高，胸腺指數顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，人參根飲液高劑量組小鼠脾指數顯著降低，人參根飲液高、低劑量組和預防1組胸腺指數均顯著升高（P＜0.05）。與空白對照組比較，模型組小鼠子宮指數降低；與模型組比較，各給藥組小鼠子宮指數升高，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖2。

圖2 小鼠胸腺、脾、子宮指數的影響Note：Compared with those in the blank control group，#P＜0.05，##P＜0.01；Compared with those in the model group，*P＜0.05，**P＜0.01（for Fig.2 and 4，Tab.1）.Fig.2 Indexes of thymus，spleen and uterus of mice

2.3 小鼠股骨組織形態學

橫切面：空白對照組小鼠股骨成骨細胞完整；模型組小鼠股骨成骨細胞凋亡，不完整且間隙較大；與模型組比較，人參根飲液高、低劑量組和預防1組小鼠股骨成骨細胞完整，間隙小。詳見圖3。

圖3 小鼠股骨組織切片（HE，×400）A.Transverse section B.Longitudinal section a1，a2.Blank control group b1，b2.Model group c1，c2.GRD high-dose group d1，d2.GRD low-dose group e1，e2.GRD prevention groupⅠFig.3 Femoral tissue sections of mice（HE，×400）

縱切面：空白對照組小鼠股骨骨小梁排列有序、致密，骨小梁飽滿，骨髓腔隙較小，形態結構較完整；模型組小鼠股骨骨小梁結構遭到破壞，連續性差，出現斷裂結構，骨髓腔增大變多；與模型組比較，人參根飲液高、低劑量組和預防1組小鼠股骨骨小梁排列有序、致密、飽滿、連續性好，骨髓腔較小，形態結構較完整。詳見圖3。

2.4 小鼠血清學指標

與空白對照組比較，模型組小鼠血清ALP和BGP，及P水平均顯著升高，Ca水平顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組比較，人參根飲液高、低劑量組和預防1組小鼠血清ALP和BGP及P水平均顯著降低，Ca水平顯著升高（P＜0.01或P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組小鼠血清ALP，BGP，Ca，P水平比較（±s）Tab.1 Comparison of serum ALP，BGP，Ca，P levels of mice in each group（±s）

表1 各組小鼠血清ALP，BGP，Ca，P水平比較（±s）Tab.1 Comparison of serum ALP，BGP，Ca，P levels of mice in each group（±s）

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2.5 大鼠股骨骨密度

與空白對照組比較，模型組大鼠骨密度值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，人參根飲液組和人參根飲液預防2組骨密度值均顯著升高（P＜0.01）。詳見圖4。

圖4 大鼠股骨骨密度Fig.4 BMD of rats

3 討論

人參含多糖類、皂苷類等有效成分，人參皂苷Rb1中的二醇類物質能調節模型大鼠體內骨形成蛋白、Smad1和ALP水平，并且能促進骨骼的形成及成骨細胞和破骨細胞的增殖與分化［11-13］。人參皂苷Rh2可預防老年大鼠骨量流失［14］，故人參皂苷Rb1及Rh2有可能是人參根飲液防治OP的潛在有效成分。本課題組前期研究發現，有效成分制備成碳量子后，能富集在2～10 nm的碳骨架內或者表面，具有骨細胞靶向吸收的作用，這也有可能是人參根飲液防治OP的原因之一。

維A酸為維生素A的衍生物，作為誘導性藥物，可影響骨的正常代謝、生長和發育，最終導致骨質疏松的發生［15-17］。維A酸復制模型具有特點明確、易操作、周期短等優點［18］。本研究中共選用7個評價指標，確保模型復制的準確性和藥效學研究的真實性，骨密度作為診斷OP的金標準，是臨床和科研最常用的方法［19］，增加骨密度可有效降低骨質疏松骨折的發生率［9］。本研究結果顯示，與模型組比較，人參根飲液組和預防組大鼠骨密度值均顯著升高，表明人參根飲液對模型鼠骨質疏松有較好的改善與預防作用。骨的病理形態學是反映骨質疏松的病理組織狀況的客觀指標。維A酸誘導骨質疏松小鼠模型復制成功后，骨重建速度加快，骨質丟失嚴重，骨小梁變薄，連接性中斷、間隙變大。本研究結果顯示，人參根飲液組小鼠骨小梁明顯增粗，排列尚整齊并連接成網，部分區域骨小梁間隙略增大，說明人參根飲液可通過改善或修復骨組織的形態結構來改善骨質疏松。

維A酸可破壞卵巢功能，降低雌激素水平，致使子宮指數降低［20］。本研究中，模型組小鼠子宮指數低于空白對照組，人參根飲液高、低劑量和預防1組小鼠子宮指數高于模型組，但差異均無統計學意義。有文獻報道，給藥周期超過3個月，子宮指數才會有明顯變化［21］，而本研究中給藥周期過短。

綜上所述，人參根飲液對骨質疏松模型鼠骨密度有積極影響，同時也對骨組織形態結構具有改善作用。該研究結果為人參根飲液預防骨質疏松的機制提供了理論依據。