長(zhǎng)鏈非編碼RNA MALAT1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其對(duì)SW620細(xì)胞增殖、遷移的影響

吳 懼，殷海鵬，程 楠，尹 敏，尹家俊，李 賀

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 肝膽外科，遼寧 大連116001；2.腫瘤生物醫(yī)療和基因檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116001；3.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連116044)

根據(jù)2021年結(jié)直腸癌癥篩查指南結(jié)果顯示，結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居惡性腫瘤第三位[1-2]。結(jié)腸癌的發(fā)病過(guò)程緩慢隱匿并且早期無(wú)典型表現(xiàn)，相關(guān)統(tǒng)計(jì)顯示早期有15%-25%發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后差，五年生存率低[3-5]。手術(shù)治療是目前根治結(jié)腸癌的主要手段。肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)是通過(guò)對(duì)非小細(xì)胞肺癌惡性行為的研究首次被發(fā)現(xiàn)，隨后又發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1不僅僅在肺癌中起作用，還參與很多其他惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程，影響著腫瘤的惡性行為[6-8]。PI3K/Akt通路參與多種惡性腫瘤的發(fā)生，在骨肉瘤、卵巢癌等惡性腫瘤的相關(guān)研究中均存在該通路的參與[9-10]，并且與LncRNA MALAT1的表達(dá)相關(guān)。在結(jié)腸癌中二者是否同樣存在某些相關(guān)性，目前尚無(wú)明確報(bào)道。本研究旨在探討LncRNA MALAT1在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況，觀察其對(duì)SW620細(xì)胞增殖、遷移的影響，并初步探究LncRNA MALAT1下游的潛在轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，闡明其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與試劑

1.1 一般資料收集大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院行結(jié)腸癌根治術(shù)患者的術(shù)后標(biāo)本40例，所有手術(shù)均為同一團(tuán)隊(duì)完成，臨床資料完整。細(xì)胞系為SW620，其高表達(dá)LncRNA MALAT1[11]。引物由大連寶生物科技有限公司設(shè)計(jì)及合成，RT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，抗體購(gòu)自華安生物技術(shù)有限公司，DAB試劑盒SP9001購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，siRNA干擾序列購(gòu)自上海吉瑪公司。

1.2 方法

1.2.2Western blot實(shí)驗(yàn) 提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)樣品蛋白定量檢測(cè)。SDS-PAGE電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉 1 h，一抗(P13K 1∶2000，Akt l∶2000，Beta-actin 1∶500)，4℃孵育過(guò)夜加二抗(1∶20 000)，室溫孵育1 h，用ECL法化學(xué)發(fā)光，用Image J分析掃描灰度值，β-actin設(shè)置為內(nèi)參照。

1.2.3免疫組化實(shí)驗(yàn) 切片55℃烤片過(guò)夜或者60℃烤片2-4 h。脫蠟后梯度濃度酒精脫水，采用高壓熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，山羊血清工作液對(duì)組織進(jìn)行封閉，滴加一抗，置于4℃冰箱過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，孵育20 min，DAB工作液顯色。復(fù)染、樹(shù)膠封片，陽(yáng)性和陰性結(jié)果依據(jù)H-score評(píng)分方法進(jìn)行判讀。

1.2.4si-RNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染 干擾序列為si-MALAT1P:5′-GGGCUGACAUUAACUACAATT-3′；si-NC：5′-UGACCUCAACUACAUGGUUTT-3′。將細(xì)胞種入6孔板中，細(xì)胞密度要求大于70% 進(jìn)行轉(zhuǎn)染；5 μl DMEM 稀釋于100 μl的無(wú)血清DMEM中，混勻，靜置5 min；將20 μl si-MALAT1及si-NC分別稀釋于100 μl的無(wú)血清DMEM 后，混勻，靜置 5 min； A、B液室溫下孵育 20 min；加入2 ml 完全培養(yǎng)基，再加入混合溶液，置于培養(yǎng)箱中。

1.2.5CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 在96孔的培養(yǎng)板內(nèi)種下待檢測(cè)細(xì)胞；分別于0 h、24 h、48 h、72 h時(shí)加入 CCK-8試劑(10 μl /孔)，避光操作，孵育 2 h；用酶標(biāo)儀對(duì)樣品吸光度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn) 在含有20%胎牛血清培養(yǎng)基的下室中放入Transwell小室(孔徑8 μm)，將細(xì)胞接種在含無(wú)血清培養(yǎng)基的上室中，培養(yǎng)24 h。PBS清洗，多聚甲醛固定，最后結(jié)晶紫進(jìn)行染色。顯微鏡下觀察拍攝。

1.2.7集落形成實(shí)驗(yàn) 在6孔板中接種轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，每孔約1000個(gè)；定期更換培養(yǎng)基，兩周后固定(無(wú)水甲醇)，染色(結(jié)晶紫)，計(jì)數(shù)菌落形成數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料采用n(%)表示，兩組間計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05表示差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織中LncRNA MALAT1的表達(dá)情況及與患者臨床特征的關(guān)系

RT-PCR技術(shù)對(duì)40例結(jié)腸癌組織及癌旁組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：癌組織中LncRNA MALAT1的表達(dá)較癌旁組織中更為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。癌組織中高于平均值水平作為高表達(dá)結(jié)果，與患者臨床特征進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1的表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性(P<0.05)(表1)。

圖1 RT-PCR法測(cè)定組織中LncRNA MALAT1的表達(dá)，P<0.05

表1 患者臨床特征與LncRNA MALAT1高表達(dá)及低表達(dá)的比較

2.2 p-PI3K、p-Akt在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察癌及癌旁組織中蛋白p-PI3K、p-Akt表達(dá)情況(圖2)，癌組織中p-PI3K的陽(yáng)性染色結(jié)果28例(70%)，癌旁組織9例(22.5%)；癌組織中p-Akt的陽(yáng)性染色結(jié)果27例(67.5%)，癌旁組織7例(17.5%)；通過(guò)卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二者在癌及癌旁組織中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=18.15，P<0.05，χ2=20.46，P<0.05)。

圖2 免疫組化法檢測(cè)組織中p-PI3k、p-Akt的表達(dá)(×200)

Wesern blot定量分析蛋白p-PI3K及p-Akt表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，在癌組織中，p-PI3K及p-Akt蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖3)。

圖3 Western blot檢測(cè)組織中p-Akt、p-PI3k的表達(dá)(P<0.05)

2.3 結(jié)腸癌患者LncRNA MALAT1的表達(dá)與p-PI3K及p-Akt的關(guān)系

將p-PI3K、p-Akt表達(dá)結(jié)果與LncRNA MALAT1的表達(dá)情況進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，其中LncRNA MALAT1表達(dá)水平高于平均值作為高表達(dá)的例數(shù)，結(jié)果顯示二者之間有明顯相關(guān)性(P<0.05)(表2)。

表2 LncRNA MALAT1與p-PI3K、p-Akt的關(guān)系

2.4 下調(diào)細(xì)胞中LncRNA MALAT1對(duì)p-PI3K、p-Akt表達(dá)的影響

通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA至癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后癌細(xì)胞中LncRNA MALAT1的表達(dá)水平明顯下降(圖4a)，對(duì)si-MALAT1及si-NC組細(xì)胞中的p-PI3K、p-Akt的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LncRNA MALAT1的表達(dá)，蛋白p-PI3K、p-Akt的水平也下降(P<0.05)(圖4b、4c、4d)。

圖4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt的表達(dá)(P<0.05)

2.5 下調(diào)LncRNA MALAT1的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-MALAT1與si-NC組細(xì)胞增殖情況如圖5a，72 h時(shí)，si-MALAT1(1.451±0.112)細(xì)胞的OD值較si-NC(2.019±0.131)組降低(t=8.405，P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，si-MALAT1組細(xì)胞遷移數(shù)較si-NC組細(xì)胞遷移數(shù)減少(圖5b、5c、5d)(P<0.05)。

圖5 細(xì)胞增殖曲線及細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移能力(×200)(P<0.05)

2.6 下調(diào)LncRNA MALAT1對(duì)細(xì)胞集落形成能力的影響

結(jié)果顯示：si-MALAT1組14.9%較si-NC組27.2%細(xì)胞集落形成率下降(P<0.05)(圖6a、6b、6c)。

圖6 細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)檢測(cè)集落形成能力(P<0.05)

3 討論

結(jié)腸癌在全球惡性腫瘤中的發(fā)病率持續(xù)上升，其轉(zhuǎn)移率高，雖然對(duì)腫瘤基因的研究越來(lái)越深入，但機(jī)制復(fù)雜，尚不明確[12]，治療方式以手術(shù)切除為主，然而術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)仍十分常見(jiàn)，有研究表明新輔助放化療和腸系膜切除聯(lián)合治療可使局部復(fù)發(fā)率降低到10%以下，但并沒(méi)有顯著延長(zhǎng)患者的生存期[13-15]。近年來(lái)，非編碼基因在腫瘤相關(guān)研究中進(jìn)展迅速，許多研究發(fā)現(xiàn)LncRNA與腫瘤的關(guān)系十分密切，可以通過(guò)影響基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)等過(guò)程參與腫瘤的進(jìn)展[16]。LncRNA MALAT1作為一種新的LncRNA在2003年肺癌的相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)[17]，隨后在其他惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)其參與并影響腫瘤的進(jìn)程，在膀胱、乳腺等惡性腫瘤中均有報(bào)道，LncRNA MALAT1促進(jìn)了惡性腫瘤的進(jìn)展過(guò)程，尤其與腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)[18]。

本研究的結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌中，癌旁組織LncRNA MALAT1的表達(dá)量較癌組織中的表達(dá)降低；轉(zhuǎn)染si-RNA后，腫瘤細(xì)胞中LncRNA MALAT1的表達(dá)下降，細(xì)胞的增殖、遷移、集落形成等能力明顯減弱。該結(jié)果與LncRNA MALAT1最初在肺癌的相關(guān)研究中結(jié)果一致[19]，而導(dǎo)致該結(jié)果的發(fā)生可能與LncRNA與其他基因相互作用有關(guān)。研究表明LncRNA MALAT1可以作用多種微小RNA來(lái)促進(jìn)其惡性行為，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在肝癌中LncRNA MALAT1可以通過(guò)抑制miR-140基因，使血管生成因子A增加；另有研究顯示LncRNA MALAT1與miR-202存在相互結(jié)合位點(diǎn)，LncRNA MALAT1表達(dá)抑制了miR-202導(dǎo)致骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)；LncRNA MALAT1還能與miR-485-3p相互作用，解除對(duì)c-MET和Akt3/mTOR信號(hào)的抑制，下調(diào)LncRNA MALAT1或過(guò)表達(dá)miR-485-3p可抑制腫瘤生長(zhǎng)和體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移[20-21]，以上均表明LncRNA MALAT1表達(dá)增高可以作用于其他的基因來(lái)行使功能。此外在胰管腺癌研究中發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1敲除后，抑制miR-217的表達(dá)，而KRAS蛋白是其明確的作用靶點(diǎn)，最終影響KRAS蛋白的表達(dá)，影響了腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲過(guò)程[22]。本研究得到LncRNA MALAT1對(duì)結(jié)腸癌的惡性行為起到了促進(jìn)作用結(jié)果，可能與LncRNA MALAT1表達(dá)增高，影響某些微小RNA的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤相關(guān)編碼基因表達(dá)發(fā)生變化，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

本研究對(duì)PI3K/Akt通路中活化的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，癌組織中LncRNA MALAT1表達(dá)高，p-PI3K和p-Akt的含量升高，下調(diào)細(xì)胞中LncRNA MALAT1表達(dá)，p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)量隨之下降。腫瘤中的PI3K/Akt通路是一條證實(shí)參與腫瘤發(fā)生的傳導(dǎo)通路，參與細(xì)胞周期的各個(gè)階段，在細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中起著不可替代的作用。研究發(fā)現(xiàn)PI3K、Akt總量相對(duì)恒定，其發(fā)揮作用取決于關(guān)鍵蛋白的活化情況，PI3K可被相應(yīng)受體激活，如RAS蛋白、酪氨酸激酶受體等，活化后的PI3K可使下游分子Akt活化為p-Akt，進(jìn)而作用于下游分子，影響細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂過(guò)程[23-25]。在腫瘤細(xì)胞中，該通路異?；罨?，可導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖、細(xì)胞凋亡，促進(jìn)新生血管形成，進(jìn)而引發(fā)腫瘤細(xì)胞分化及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性行為[26]。LncRNA MALAT1可以通過(guò)PI3K/Akt途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，影響腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性[27]；在骨肉瘤中PI3K/Akt信號(hào)通路可以被LncRNA MALAT1激活，從而使腫瘤發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[28]。而結(jié)腸癌中LncRNA MALAT1與PI3K/Akt通路的關(guān)系尚未明確。根據(jù)既往研究及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為在結(jié)腸癌中，LncRNA MALAT1與PI3K/Akt通路存在一種正向的相關(guān)性，影響了腫瘤的進(jìn)展。

綜合以上結(jié)果，LncRNA MALAT1在結(jié)腸癌中的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了腫瘤的增殖、遷移；并且與PI3K/Akt通路存在著一種正相關(guān)性。