細胞外囊泡作為一種新型腫瘤標志物在肝癌診治中的研究進展

許京倫,孟子輝

(吉林大學中日聯誼醫院 肝膽胰脾外科，吉林 長春130033)

肝癌(HCC)是全球范圍內非常常見的一種惡性腫瘤，其發病率及死亡率均較高，也是癌癥死亡的最常見的原因之一，其發病率在消化系統的惡性疾病中排名第3位，僅略低于胃癌及食管癌[1]。HCC腫瘤生長及轉移速度較快，預后較差，生存周期較短，且發現時往往為腫瘤晚期，每年大約有84萬例肝癌新發患者，至少有78萬人死于肝癌[2]。近年來，細胞外囊泡(EVs)在HCC的發展轉移及診斷和治療中的作用引起了廣泛關注。EVs及其包裹的蛋白質、miRNAs和lncRNAs可為肝細胞癌提供新的診斷標志物，同時，EVs也是治療肝細胞癌的潛在靶點[3]。EVs與癌癥相關，包括癌癥進展、血管新生、藥物抵抗、免疫逃逸及腫瘤相關血栓的形成等[4-5]。本文綜述了EVs的產生、分離方法及其在HCC的發展、轉移及診斷與治療中所扮演的角色。

1 EVs

1.1 EVs的產生

EVs由磷脂雙分子層及各種囊內容物組成，是一種由細胞主動向外釋放的膜性小囊泡，EV內容物組成包括與膜相關的功能蛋白和腔蛋白、脂質、代謝物和核酸，特別是mRNAs和microRNAs，它們是發揮旁分泌和系統作用的生理和病理信息的來源，它們被磷脂雙分子層包裹，并保護它們不被降解，甚至可以將其傳遞到遠離囊泡起始處的位置[6]。根據生物學特性或釋放途徑不同可將EV分為微囊泡(MV)、外泌體、內體和凋亡小體。MV直接從細胞膜釋放，直徑為100 nm～1 μm；外泌體直徑為30～120 nm，由細胞內多泡體釋放；內體主要由惡性組織細胞產生，直徑為1～10 μm；凋亡小體直徑為50 nm～2 μm，由凋亡細胞釋放[7]。其中研究最全面、最常用于腫瘤治療的是外泌體。

1.2 EVs的提取

診斷用EVs的來源不僅限于血液，還包括唾液、尿液、腹水、胸腔積液、支氣管肺泡液，甚至呼氣。EVs因體積小、密度低，很難將其進行高純度高效率的分離，且其理化性質會根據不同的分離方法產生不一樣的結果，因此，各種各樣的分離方法會產生大量的不可控因素，故尋找一種分離純度及分離效率較高，便于操作并廉價的分離方式是目前急需解決的難題。首先根據EVs的不同沉降特性從培養的肝癌細胞的培養上清液或血漿中分離它們，目前的分離方式主要包括：超速離心法[8]、密度梯度離心法[9]、尺寸排阻色譜法[10]、超濾法[11]、聚乙二醇沉淀法[12]、免疫磁珠分選法[13]。超速離心法是最常用的方法，可以在消耗較少試劑的情況下，從大量樣品中分離出EVs，然而此方法分離的EVs純度較低，操作簡單，可用于大批量樣本，缺點是所需器械非常昂貴，且分離時間較長，離心力過大，可能會影響到分離結果的完整性； 密度梯度超速離心法較超速離心法可以提高分離效率，縮短分離時間，并可提高分離的純度的同時相對較好的保持EVs的活性，然而總耗費時間仍較長，并需要高度注意配制惰性梯度介質時需把握其滲透壓，因此，前兩種分離方法都存在的劣勢，即昂貴且耗時耗力，臨床應用有限。尺寸排阻色譜法相比較而言，高度保持了主要EVs的特點，包括泡狀結構和內容，分離的EV純度較高，這為將來的應用提供了保證，但需要特殊的儀器，得到的EVs樣本量非常少，同樣耗時耗力，因此也限制了其應用。超濾法簡單高效，廉價且分離周期較短，但問題在于所分離得到的EVs數量較少，且純度較低； 聚乙二醇沉淀法操作簡便，省時省力，但純度較低，且假陽性率高，其結果容易受到其他疏水蛋白質的影響。免疫磁珠分選法特異性好，純度高，但同樣受制于其特殊的設備和高昂的成本。近年來有研究提出將超濾法和超速離心法相結合的辦法，可有效分離出EVs的不同亞群，應用前景可觀[14]。

1.3 EVs的功能

EVs功能取決于其內容物組成包括與膜相關的蛋白、脂質、代謝物和核酸。細胞在不同的狀態分泌的EVs內含物不同，每一個EVs都會攜帶特定的分子信息，包裝的獨特分子構成決定了要傳遞給受體細胞的細胞外信號的類型，而且由一個復雜的分選系統來決定那些分子能夠進入細胞外囊泡。在不同的肝臟疾病中，這些囊泡的數量和內容物均可不同，且都能對細胞間的信息傳遞進行調控[7]。目前關于EVs形成、釋放及EVs內成分被分選進入腔內囊泡的具體機制仍不清楚。有研究證明了來源于培養中的腫瘤的EVs和來自同一腫瘤患者血清的EVs具有相同的分子圖譜[15]。EVs是細胞間信息傳遞的重要紐帶，肝臟和其他組織分泌的EVs為臨床診斷各種肝臟疾病提供了重要的生物標志物。免疫細胞分泌的EVs可以傳遞免疫相關信息，在機體抗腫瘤的過程中發揮重要作用。根據所含內容物、成熟狀態、靶細胞類型的差異，免疫細胞分泌的 EVs 可通過激活或抑制相關免疫反應影響腫瘤進展，因此，充分利用其特點，有效對抗腫瘤。EVs的表面分子能夠使其定位到靶細胞，與靶細胞結合后，EVs可以通過受體-配體相互作用發出信號，或通過內吞作用和(或)吞噬作用甚至是與靶細胞膜融合將其內容物遞送至胞質液中改變受體細胞的生理狀態。正因為這一特性，EVs可參與免疫反應和抗原遞呈，對免疫系統的激活、腫瘤免疫逃逸，以及腫瘤的遠端轉移過程、血管生成、組織再生和神經變性疾病等都發揮著重要的作用。Muller等對脂質進行熒光標記后發現，EVs能通過脂質融合的方式進入靶細胞內，EVs的蛋白質和核酸可以被轉運至目標細胞內，同時下游細胞的變化使EVs內在化。

2 EVs促進肝癌發展及轉移的機制

肝細胞癌發生的原因是因為出現多個介導腫瘤行為、局部擴散和多灶性腫瘤發展信號通路失調,這些信號通路都可能被一種細胞間信號所調節，這種信號可以促進細胞信號和反應，使克隆增殖、非錨定生長和腫瘤擴散成為可能。細胞間信號轉導的表觀遺傳調控可能是肝癌發生的重要機制[16]。研究發現，EVs在肝細胞癌的進展與轉移中起重要作用，它可以通過影響腫瘤微環境，如促進細胞增殖[17]和上皮-間充質轉化(EMT)[18]，增加血管生成中的管狀形成和逃避免疫監視[19]的能力來介導癌癥進展。

從不同來源的肝癌細胞(高轉移MHCC97-H和低轉移MHCC97-L細胞)中分離EVs，進行體外遷移和侵襲實驗。結果表明，MHCC97-H衍生EVs預處理的MHCC97-L細胞的運動能力明顯高于MHCC97-L-外泌體預處理[20]。腫瘤來源的EVs通過誘導效應T細胞的凋亡來促進腫瘤的進展及其免疫逃逸。腫瘤來源的EVs不同于樹突狀細胞(DC)或T細胞來源的EVs，它擁有獨特的分子特征和免疫抑制功能，這有助于腫瘤逃避宿主免疫系統[15]。miRNA可調節許多細胞的發育過程，在癌癥的發展和進展中起重要作用[21]，MiRNA是一種常見的非編碼RNA，約有22ntRNAs，通過靶向調控mRNA的切割或翻譯抑制從而參與多種生物學過程。轉化生長因子 β 活化激酶 1(TAK1)是絲裂原活化蛋白激酶(MAP3K)家族的上游成員，可以維持肝臟細胞內穩態并抑制腫瘤的發生，HCC 細胞來源的 EVs 可通過其運載miRNA調節 TAK1的表達及相關信號，從而提高受體細胞的非依賴性增殖[16]。MCs釋放的血管生成因子、基質金屬蛋白酶(MMPs)和免疫抑制性細胞因子可為腫瘤提供支持性環境。有研究發現，在重現細胞間接觸的條件下，癌細胞不但可以直接激活MCs，其驅動的EV還具有激活腫瘤周圍MCs的可能性。

免疫細胞來源的EVs存在一種黏附受體整合素αMβ2，它可以調節免疫細胞的遷移，而這些EVs會被HCC細胞所攝取，從而增強HCC細胞的遷移、侵襲能力以及對內皮細胞的趨附性和遠端轉移能力[22]。

3 EVs在 HCC診斷中的作用

EVs以非均一膜性囊泡的結構廣泛散在于各類體液中，可以成為一種無創的液體活檢技術，其內容物受到其外層的膜的保護而擁有更高的穩定性，克服了其在體液中易被降解等特性。相對于組織病理檢查，基于血清等樣本的EVs檢測具有無創、取樣簡便等優勢，患者依從性更高。根據靶基因和表達水平的不同，miRNA既可能是腫瘤抑制基因，也可能是癌基因，既可能促進也可能抑制癌癥的生長和進展。肝細胞或腫瘤細胞分泌的EVs可通過細胞外液進入血液循環，其攜帶的內容物信息可反應起初分泌時親代細胞的狀態，且這些內容物信息會隨著親代細胞分泌EVs時的狀態和所處環境的改變而變化，EVs中的miRNA對核糖核酸酶具有抗性，所以它們在血液中是穩定的，因此EVs可以成為新的HCC診斷標志物[23]。

眾所周知，HCC的發病與慢性肝炎及肝炎后肝硬化密切相關，慢性肝炎、肝硬化為肝癌的高危人群，此類人群檢查腫瘤診斷標志物有助于早期發現HCC，對后續治療能有極大的改善。慢性肝炎的炎性細胞因子IL-6和腫瘤壞死因子-α(INF-α)可以通過抑制miRNA-122的兩種轉錄因子C/EBpα和HNF3β，并誘導c-myc介導的C/EBpα抑制，從而下調miRNA-122的表達，最終使miRNA-122在肝炎中的下調有助于腫瘤的發生[24]。因此，當循環血液中EVs所包裹的miRNA-122數量明顯減少時，需高度警惕肝癌的發生。循環中的microRNAs miR-939、miR-595、miR-519d和miR-494可識別患有肝癌的肝硬變患者[25]。Zhou等人通過研究亞洲地區人口發現[26]，在區分患有和不患有肝癌的肝硬化患者的miRNA中，發現了循環中高水平的miR-595和miR-765，因此，循環miR-595和miR765作為與肝細胞癌相關的循環miRNAs有望區分有肝細胞癌和無肝細胞癌的肝硬化患者。Tomimaru等人發現[27]，無論是否存在肝硬變或慢性肝炎感染狀態，肝細胞癌患者的miRNA-21循環水平較正常人都明顯增加了，但其并沒有進行在有無攜帶腫瘤的慢性肝炎或肝硬化的患者之間進行比較，因此其肝癌的診斷效果仍需進一步研究。Li等人提出，與正常人相比，肝癌患者的血清miRNA-221水平升高，且miRNA-221水平增高與肝硬化的存在有非常密切的聯系[28]。長鏈非編碼RNA(LncRNAs)作為一種內源競爭RNA(ceRNA)，可以通過競爭性結合miRNA來調節基因的表達，最終增加癌細胞的增殖與轉移能力[29]。Baoguo Li等人的研究發現[30]，LncRNA FAL1在肝細胞癌組織中表達上調，并通過與miRNA-1236競爭性結合在肝細胞癌中發揮基因調節作用，促進肝細胞的增殖和轉移。同時，LncRNA FAL1在肝癌患者血清EVs中也表達上調，因此，可以通過檢測血清EVs中的LncRNA FAL1水平來推測是否有HCC的發生。

EVs還可作為預測肝癌患者生存及預后的標志物，Min Shi等人通過回顧性研究發現，血清EVs中miRNA-638水平較低的肝細胞癌患者的總體生存率低于miRNA-638水平較高的患者[31]，因此，可以認為血清EVs傳遞的miRNA-638可能成為一種可以預測HCC預后的循環診斷標志物。對抗腫瘤藥物敏感的腫瘤細胞向耐藥細胞轉化可視作明顯使預后變差的重要因素。多藥耐藥癌細胞可通過EVs將miR-32-5p傳遞給對藥敏感細胞，并激活其PI3K/Akt通路，通過調節血管生成和EMT進一步誘導多藥耐藥[18]。LING-XIANG YU等人通過提取肝癌患者的快速遷移細胞及緩慢遷移細胞的EVs，使用miRNA測序分析鑒定出其中差異表達的miRNA，與慢遷移組相比，快遷移組中5個miRNAs(miR-140-3p、miR-30d-5p、miR-29b-3p、miR-130b-3p和miR-330-5p)下調，1個miRNA(miR-296-3p)上調，并且其中的MiR-30d、miR-140和miR-29b三個miRNAs與患者的生存時間明顯相關[32]。原發腫瘤來源的EVs可通過SMAD3(SMAD 家族成員3)蛋白調節循環腫瘤細胞的黏附促進肝癌轉移,并且肝癌患者外周血中含有豐富SMAD3蛋白的EVs[33]，這也提示著，外周血EVs中若含有大量的SMAD3蛋白可能代表著腫瘤有更高的轉移能力。

4 EVs在HCC中的治療作用

研究證實肝臟是靜脈注射EVs后主要的攝取部位。免疫細胞來源的細胞外囊泡通過調節免疫系統來增強或抑制免疫活動，在抗腫瘤過程中發揮重要作用。將AFP基因修飾在DCs上，使得DCs表達AFP(DCAFP)，隨后，收集DCAFP產生的外泌體DEXAFP。DEXAFP具有與DCs同等的免疫刺激能力，可以激活僅對表達AFP的肝癌細胞起作用的AFP特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。DEXAFP可誘導較強的抗原特異性免疫反應，顯著抑制小鼠肝癌的生長，延長小鼠的生存壽命[34]。并提示增加miRNA-122可能是預防CHB患者肝細胞癌發展的有效策略。值得注意的是，用agomiR-122治療阻斷二乙基亞硝胺(DEN)-誘導的miR-122下調顯著減緩了小鼠肝癌的發展[35]。Sheung-Fat Ko等人通過使用脂肪來源的間充質干細胞(ADMSCs)的EVs治療患有HCC的小鼠(實驗組)，并與未經治療的HCC小鼠(對照組)比較腫瘤生長速度和生存壽命，發現對照組的肝細胞癌迅速增大，經過治療10天后，實驗組的腫瘤體積明顯小于對照組，并且還發現外周血和瘤內自然殺傷T細胞(nNKT-cell)明顯增多[36]，ADMSC來源的EVs可促進大鼠NKT細胞的抗腫瘤反應，從而促進肝癌抑制。Vps4A作為一種EVs生成的關鍵調節器，具有抑制HCC細胞生長、集落形成、遷移及侵襲的能力。Vps4A不但促進攜帶有致癌miRNA的EVs釋放，而且在細胞中攝取并積聚抑癌miRNA。以上研究證實EVs轉運miRNA是HCC細胞中miRNA特征性表達的重要自調機制，Vps4A可通過EVs調節miRNA在HCC細胞中的釋放及攝取，從而實現抑癌作用。

5 小結

HCC作為一種高度惡性的腫瘤，全球范圍內發病率都很高，且腫瘤發現時多數分期較晚，其預后往往極差，死亡率較高，而EVs雖然在腫瘤發生發展中起重要作用，但只要通過合理的應用，它也可以成為一種新發現的診斷與治療手段，為腫瘤患者帶來福音。目前已有研究提出許多種提取EVs的方法，近來也有人嘗試將多種分離方式相結合的辦法，但總體來說目前的分離方法仍存在價格高昂、條件苛刻、分離純度較低和分離時間較長的缺陷，研究出方便廉價，分離效率、純度高的分離方式是目前急需解決的難題。在HCC高危人群即慢性肝炎和肝硬化患者中，若檢測EVs時發現其中某些核苷酸的改變，如miRNA-122水平降低，miRNA -939、miRNA -595、miRNA -519d、miRNA -494、miRNA-21、miRNA-221 和LncRNA FAL1水平升高，則需要高度注意是否有HCC的發生，或許能夠早期發現HCC而改善患者的預后。同樣，EVs在已確認肝癌患者中擁有著提示預后的作用，如血清EVs中miRNA-638水平較低的肝細胞癌患者生存壽命可能較短，快遷移腫瘤細胞中有5個miRNAs(miR-140-3p、miR-30d-5p、miR-29b-3p、miR-130b-3p和miR-330-5p)下調，因此可以猜想此類miRNA在外周血EVs中的低表達可能提示著腫瘤遷移速度較快，嚴重影響患者的預后，此外還有1個miRNA(miR-296-3p)在快遷移腫瘤細胞中上調，它在外周血EVs中的高表達或許同樣提示著腫瘤有較強的遷移能力。肝癌患者外周血EVs中存在的豐富SMAD3蛋白，可以通過循環腫瘤細胞的黏附促進肝癌轉移同樣可以提示較差的預后。雖然有大量理論研究表明，EVs在治療HCC中可能有較大的發展空間，但只是在小鼠實驗中得到體現，目前并沒有投入臨床治療觀察中，盡管如此，它仍可以帶給很多驚喜，為研究出新的肝癌治療手段提供方向。然而，EVs并未進行臨床的實際應用，其作為一種新型腫瘤標志物在腫瘤診斷與治療中的應用仍需進一步的理論與實驗研究觀察。