肝細胞癌組織Foxj2、PCDH20的表達與臨床病理特征和預后的關系

馬慧發,王劭煒,楊士民

(1.天津市天津醫院 普通外科,天津300200;2.天津市南開醫院 胃腸外科,天津300100)

肝癌在2018年全球惡性腫瘤流行病學調查中居發病率第7位、死亡率第3位[1]。我國肝癌的發病率和死亡率分別為26.92/10萬和23.72/10萬，居惡性腫瘤發病率第4位、死亡率第2位，其中肝細胞癌(HCC)在原發性肝癌中占比85%-90%，嚴重威脅人民生命健康[2]。近年來，有學者通過動物實驗發現小鼠肝癌細胞內叉頭框蛋白J2(Foxj2)基因對Smad2、Smad4等基因表達有抑制作用，從而對肝癌細胞增殖進行抑制[3]。另有研究提示原鈣黏蛋白-20(PCDH20)是非成簇原鈣黏蛋白的重要組成部分，其調節功能廣泛，在神經系統信號傳導、細胞增殖與凋亡中均有調節作用，且與鼻咽癌、肺癌等惡性腫瘤有關[4]。本研究擬分析Foxj2、PCDH20在HCC組織中的表達情況，探討二者與預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入天津市天津醫院2013年5月-2016年5月收治的HCC患者83例。納入標準：經手術(肝癌根治性切除術)切除標本病理檢查證實為HCC者，年齡>18歲；首次確診的患者；未見遠處轉移者；術前血常規、AFP、腹部超聲、CT或MRI等檢查完善者；具備手術指征，均完成手術者；自愿簽署知情同意書者。排除標準：患免疫系統、血液系統疾病者；入院前近6個月內有大手術史者；患其他部位的原發性腫瘤者；患嚴重心腦血管疾病者(例如心肌梗死、腦梗死等)；有精神障礙史者。

其中男48例，女35例，年齡34-70歲，平均(55.29±12.24)歲；TNM分期：T1期18例，T2期35例，T3a期30例；乙肝表面抗原(HBsAg)陽性48例，陰性35例；Child-Pugh分級：A級55例，B級28例。研究方案獲醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1檢測方法 采用免疫組化法測定HCC組織、癌旁組織(距離腫瘤3-5 cm)中Foxj2、PCDH20表達情況。DAB顯色試劑、中性樹膠、Foxj2多克隆抗體、PCDH20多克隆抗體，均購于上海科敏生物科技有限公司。

1.2.2檢測結果評估 免疫組化結果分析[5]：由2名高資質的病理科醫生采用雙盲法閱片，在高倍視野(×200)下觀察切片染色情況，以出現棕黃、棕褐色顯色提示為陽性細胞。染色強度計分：無著色、淺黃、棕黃、棕褐色分別計0、1、2、3分。陽性細胞占比計分：<1%、1%-25%、25%-50%、50%-75%、≥75%分別計0、1、2、3、4分。二者乘積為最終染色計分結果，0-2分為陰性，≥3分為陽性。

1.2.3血常規、AFP及HBsAg檢查 在患者入院當日，采集4 ml肘靜脈血分裝為兩管，其中一管離心10 min(轉速3 000 r/min,半徑11 cm)，分離血清，存至-80℃下備用；另一管不做離心處理，加入抗凝劑，以相同條件保存備用。采用化學發光免疫分析法檢測血清AFP水平，試劑盒購自深圳市新產業生物醫學工程股份有限公司；采用BC-6800Plus全自動血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)測定血小板計數(PLT)、中性粒細胞與淋巴細胞比值(NLR)；通過化學發光免疫分析法測定HBsAg，試劑購自日本希森美康株式會社。

1.3 隨訪跟蹤

隨訪時間為5年，以患者術后第1 d為起始日，隨訪截止時間為2021年5月，隨訪方式根據患者的實際情況選擇，包括門診隨訪、電話隨訪、微信隨訪。記錄患者術后5年累積生存時間，累積生存時間即術后第1 d至死亡的時間。

1.4 統計學方法

經SPSS20.0軟件行數據分析。以百分比(%)表示計數資料，行χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗分析不同Foxj2、PCDH20表達患者的無瘤生存率與累積生存率。利用Spearman相關性分析Foxj2、PCDH20表達的相關性。經COX風險回歸模型分析HCC患者的預后影響因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC組織、癌旁組織中Foxj2、PCDH20表達比較

HCC組織中Foxj2、PCDH20陽性表達率低于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 HCC組織癌旁組織中Foxj2、PCDH20表達比較[n(%)]

2.2 HCC患者Foxj2表達與臨床病理特征的關系

根據Foxj2表達情況將患者分為Foxj2陰性組、Foxj2陽性組。Foxj2陰性組臨床分期T3a期、門靜脈癌栓、多發腫瘤(經肝癌根治性切除術后檢查證實)、HBsAg陽性、低分化、腫瘤直徑≥5 cm人數占比高于陽性組(P<0.05)，兩組性別、年齡、術前PLT、術前NLR、術前AFP、Child-Pugh分級比較無差異(P>0.05)，見表2。

表2 HCC患者Foxj2表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 HCC患者PCDH20表達與臨床病理特征的關系

PCDH20陰性組臨床分期T3a期、門靜脈癌栓、多發腫瘤、HBsAg陽性、低分化、腫瘤直徑≥5 cm人數占比高于陽性組(P<0.05)，兩組性別、年齡、術前PLT、術前NLR、術前AFP、Child-Pugh分級比較無差異(P>0.05)，見表3。

表3 HCC患者PCDH20表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 不同Foxj2、PCDH20表達患者的預后比較

隨訪5年，在83例患者中，有8例失訪。Foxj2陰性組的累積生存率為21.15%(11/52)，Foxj2陽性組的累積生存率為52.17%(12/23)；Foxj2陰性組累積生存率低于陽性組(Log-rankχ2=4.869，P=0.027)。PCDH20陰性組累積生存率為21.82%(12/55)，PCDH20陽性組累積生存率為55.00%(11/20)；PCDH20陰性組累積生存率低于陽性組(Log-rankχ2=4.486，P=0.034)。具體生存曲線圖見圖1-2。Spearman相關分析提示HCC患者Foxj2與PCDH20表達呈正相關(rs=0.624，P<0.001)。

圖1 不同Foxj2表達患者的累積生存曲線圖

2.5 HCC患者預后的COX風險回歸模型分析

將相關變量納入COX風險回歸模型，以HCC患者預后為因變量X(生存=0，死亡=1)，結果提示臨床分期T3a期、門靜脈癌栓、低分化是預后的危險因素，而Foxj2、PCDH20陽性表達是預后的保護因素(P<0.05)，見表4。

表4 HCC患者預后的COX風險回歸模型分析

3 討論

HCC是較常見的一種惡性腫瘤，目前，手術切除仍是治療HCC的主要方式，隨著臨床診療技術的進步，外科手術方案較過去已取得了較大進展，但總體生存率仍不理想，據既往研究報道HCC術后1年、3年、5年的生存率分別為85.5%、66.7%、20.7%[6-7]。

圖2 不同PCDH20表達患者的累積生存曲線圖

近年來，研究指出肝癌致病原因復雜，涉及到環境、遺傳、慢性肝炎、細菌感染等多種因素，上述因素可能通過影響肝細胞中的信號轉導，導致相關基因、蛋白表達出現異常改變，參與腫瘤進展[8-9]。動物實驗發現Foxj2能對肝癌小鼠的HepG2細胞體外增殖進行抑制，并可抑制腫瘤生長[10]。另有研究認為PCDH20對Wnt/β-catenin信號通路有調控作用，可發揮抑癌功能[11]。

Foxj2是叉頭框蛋白家族的一員，在非小細胞肺癌組織中Foxj2陽性表達低于癌旁組織，它可通過調節鈣黏蛋白基因轉錄影響細胞浸潤、遷移[12]。另有研究指出Foxj2在非小細胞肺癌組織中表達下調，其過表達能對轉化生長因子-β1誘導的上皮-間充質轉化進行抑制，而將其敲除，則可促進上皮-間充質轉化，導致腫瘤進展，這表明Foxj2可能通過調節上皮-間充質轉化發揮作用，這可能是Foxj2在腫瘤中的一種作用機制[13]。PCDH20是非成簇原鈣黏蛋白的重要組成部分，生物功能非常廣泛，在神經系統信號傳導中有調節作用，具有抑癌功能，其異常表達對肝癌患者耐藥性有較大影響，PCDH20表達降低，可導致肝癌患者對5-氟尿嘧啶的耐藥性增強，其過表達則能使肝癌耐藥性降低，這提示PCDH20在肝癌中發揮抑癌作用[14]。Foxj2、PCDH20在HCC中均具有抑癌作用，二者在HCC組織中表達下調可能與患者自身的癌細胞增殖過快，機體抗癌作用下降有關。

HCC患者的臨床病理特征復雜，其病理表現的復雜性可能與相關癌基因、蛋白的表達相關[15]。本研究結果發現HCC患者Foxj2、PCDH20表達與臨床分期、門靜脈癌栓、腫瘤數目、分化程度及腫瘤直徑有關。Foxj2、PCDH20在肝癌中發揮抑癌作用，二者陰性表達提示抑癌作用削弱，導致HCC患者病情進一步進展，臨床分期增高，分化程度降低，腫瘤體積增大，增加了門靜脈癌栓以及多發性腫瘤發生風險。本研究顯示Foxj2、PCDH20陰性表達HCC患者5年累積生存率較陽性患者降低，二者呈正相關且陽性表達是患者預后的保護因素。Foxj2可能通過對E-鈣黏蛋白基因轉錄進行調控，從而調節癌細胞浸潤與轉移[16]，而PCDH20在HCC中可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路產生抑癌作用[17]。Foxj2、PCDH20在肝癌中均具有重要調控作用，二者的陰性表達能促進肝癌進展，可能通過調控與肝癌相關的信號通路或因子，共同影響肝癌患者病情。

綜上所述，HCC組織中Foxj2、PCDH20的陰性表達率較高，二者陰性表達會降低患者5年累積生存率，導致預后不良。