補腎壯筋湯治療膝骨關節炎作用機制的網絡藥理學研究

王偉偉，歐志學，章曉云，李統

(1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011；2.桂林市中醫醫院，廣西 桂林 541002)

膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種常見的關節退行性疾病[1]，尋求安全有效的治療方案具有重要意義。中醫藥治療KOA具有較好的臨床療效，而且不良反應較少。補腎壯筋湯出自《傷科補要》，是臨床治療KOA肝腎虧虛證的常用方劑。但由于該方成分較為復雜，具體的作用機制尚未完全明確。為此，本研究采用網絡藥理學方法探討了補腎壯筋湯治療KOA的作用機制，現總結報告如下。

1 材料與方法

1.1 補腎壯筋湯活性成分篩選及靶點預測利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)檢索并篩選補腎壯筋湯組成藥物“熟地黃”“青皮”“白芍”“茯苓”“山茱萸”“續斷”“杜仲”“當歸”“牛膝”的活性成分(篩選條件：口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18)；在中藥分子機制的生物信息學分析工具(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)中檢索補腎壯筋湯組成藥物“五加皮”的活性成分，并按照Lipinski類藥五原則進行篩選，即分子量<500、氫鍵供體數<5、氫鍵受體數<10、脂水分配系數<5、旋轉鍵<10[2]。在PubChem中檢索補腎壯筋湯活性成分的結構式，將結果導入Swiss TargetPrediction數據庫檢索活性成分對應的靶點，按照Probability≥0.7進行篩選，匯總篩選結果并去除重復項。

1.2 補腎壯筋湯治療KOA靶點預測以“knee osteoarthritis”為關鍵詞，在GeneCard數據庫中檢索KOA的靶點。將檢索結果和篩選出的補腎壯筋湯靶點導入Bioinformatics & Evolutionary Genomics網站，將二者取交集，預測補腎壯筋湯治療KOA的靶點。

1.3 補腎壯筋湯治療KOA關鍵靶點篩選將篩選到的補腎壯筋湯治療KOA的靶點基因導入String數據庫，分析各靶點蛋白之間的相互作用情況，設置置信度>0.9，隱藏游離蛋白。將String數據庫的分析結果導入Cytoscape3.7.2軟件，構建補腎壯筋湯治療KOA靶點蛋白互作網絡，并利用該軟件Network Analyzer工具中的MCODE插件篩選關鍵蛋白模塊，設置度值=2、節點得分=0.2、最大深度=100。

1.4 補腎壯筋湯治療KOA主要活性成分篩選先篩選出與補腎壯筋湯治療KOA的作用靶點有關的活性成分，再將其與補腎壯筋湯治療KOA的作用靶點、補腎壯筋湯組成中藥一同輸入Cytoscape3.7.2軟件，構建補腎壯筋湯治療KOA“中藥-活性成分-靶點”網絡，分析補腎壯筋湯治療KOA的主要活性成分。

1.5 補腎壯筋湯治療KOA靶點基因功能及信號通路分析將1.3中String數據庫的靶點分析結果導入DAVID數據庫，進行補腎壯筋湯治療KOA靶點基因GO富集分析和KEGG富集分析。利用R3.6.2軟件將富集分析結果可視化。

1.6 補腎壯筋湯治療KOA主要活性成分與關鍵靶點分子對接取1.3和1.4篩選出的關鍵靶點和主要活性成分，運用Autodock vina1.1.2軟件進行分子對接。通過PDB數據庫搜索關鍵靶點的3D結構，并使用Pymol1.7.2.1軟件對其進行預處理，即使用盒子對蛋白進行定位，并對蛋白結構進行殘基修補、去除水分子、添加氫原子和電荷，以PDBQT格式保存。通過PubChem數據庫下載主要活性成分的結構，并基于MMFF94力場對其進行優化。以原配體所在位點作為關鍵靶點的活性口袋，進行主要活性成分和關鍵靶點的分子對接。選取結合能較好的分子對接結果，通過Protein-Ligand Interaction網站和Pymol1.7.2.1軟件進行可視化。

2 結 果

2.1 補腎壯筋湯活性成分篩選及靶點預測結果在TCMSP和BATMAN-TCM共篩選到補腎壯筋湯的活性成分99個，預測到對應的靶點768個(表1)。

表1 補腎壯筋湯的活性成分及靶點數量

2.2 補腎壯筋湯治療KOA靶點預測結果共篩選到KOA的靶點989個，將其與768個補腎壯筋湯靶點取交集后得到172個共同靶點，即補腎壯筋湯治療KOA的靶點。

2.3 補腎壯筋湯治療KOA關鍵靶點篩選結果將172個靶點基因導入String數據庫分析后得到148個節點(即148個靶點基因)、490對蛋白互作關系，構建的補腎壯筋湯治療KOA靶點蛋白互作網絡見圖1。通過MCODE插件篩選到1個包含15個靶點的關鍵蛋白模塊(圖2)，這些靶點即為補腎壯筋湯治療KOA的關鍵靶點，分別為促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase ，MAPK)1、Akt激酶(akt kinase，AKT)1、淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)、Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(harvey rat sarcoma virus oncogene homolog，HRAS)、MAPK8、白細胞介素(interleukin，IL)-6、激肽原1(kininogen 1，KNG1)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、熱激蛋白90AA1(heat shock protein 90AA1，HSP90AA1)、JUN原癌基因(JUN proto-oncogene，JUN)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、MAPK14、IL-2、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、凝血因子Ⅱ(blood coagulation factorⅡ，F2)。

圖1 補腎壯筋湯治療膝骨關節炎的靶點蛋白互作網絡

圖2 補腎壯筋湯治療膝骨關節炎的靶點蛋白

2.4 補腎壯筋湯治療KOA主要活性成分篩選結果補腎壯筋湯99個活性成分中與補腎壯筋湯治療KOA的靶點有關的活性成分共64個(表2)。構建的補腎壯筋湯治療KOA“中藥-活性成分-靶點”網絡(圖3)顯示，度值前5位的活性成分，即補腎壯筋湯治療KOA的主要活性成分分別為漢黃芩素(wogonin)、啤酒甾醇(cerevisterol)、槲皮素(quercetin)、黃芩素(baicalein)、山奈酚(kaempferol)。

表2 補腎壯筋湯的部分活性成分

續表2

圖3 補腎壯筋湯治療膝骨關節炎“中藥-活性成分-靶點”網絡圖

2.5 補腎壯筋湯治療KOA靶點基因功能及信號通路分析結果將String數據庫分析后得到的148個靶點上傳至DAVID數據庫。GO富集分析(圖4)共得到684個條目，其中細胞組分64個、生物過程516個、分子功能104個，生物過程主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的調控、凋亡過程的負調控、信號傳導、調控細胞增殖、轉錄等，分子功能主要涉及蛋白質結合、ATP結合、鋅離子結合、相同蛋白質結合、酶結合等，細胞組分主要涉及細胞內質膜、細胞質、細胞核、胞質溶膠、核質等。KEGG富集分析(圖5)共得到111條通路，排除與KOA聯系不夠密切的通路，共篩選出磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-AKT、MAPK、TNF等3條主要信號通路。

圖4 補腎壯筋湯治療膝骨關節炎靶點基因GO富集分析柱狀圖(前10位)

圖5 補腎壯筋湯治療膝骨關節炎靶點基因KEGG富集分析氣泡圖(前20位)

2.6 補腎壯筋湯治療KOA主要活性成分與關鍵靶點分子對接結果分子對接結果顯示，5個主要活性成分與15個關鍵靶點均有良好的結合能力，結合能均≤-5.0 kJ·mol-1(表3)。取每個主要活性成分與關鍵靶點結合能最好的組合進行可視化，分子對接圖顯示活性成分大多嵌入靶點活性口袋的疏水區，結合模式多以π-π作用和氫鍵為主，提示其具有較好的結合活性，結合后構象穩定(圖6)。

表3 補腎壯筋湯治療膝骨關節炎主要活性成分與關鍵靶點的結合能 單位：kJ·mol-1

圖6 補腎壯筋湯治療膝骨關節炎的主要活性成分與關鍵靶點分子對接圖

3 討 論

從本研究的結果來看，漢黃芩素、啤酒甾醇、槲皮素、黃芩素、山奈酚為補腎壯筋湯治療KOA的主要活性成分。相關研究表明，漢黃芩素能抑制人軟骨細胞中NO、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等炎癥因子的表達，同時誘導核因子E2相關因子2轉位至細胞核，與抗氧化反應元件結合，發揮抗氧化作用[3]。啤酒甾醇是從內生真菌乙酸乙酯提取物中分離出的一種活性化合物[4]，能阻斷脂多糖誘導的誘導型一氧化氮合酶和環氧合酶2表達上調，抑制其發揮免疫抑制作用，以及抑制NO、PGE2等炎癥因子的釋放[5]。槲皮素則具有抗氧化應激、抗炎等作用[6]，可降低基質金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13，MMP-13)以及IL-1β等細胞因子的表達，從而抑制細胞外基質的降解來保護關節軟骨[7]。作為黃芩主要活性成分之一的黃芪素，目前已被相關研究證實具有抗病毒、抗氧化、抗炎以及鎮痛等作用[8-9]。楊波等[10]通過實驗發現，黃芩素可通過調節miR-29a-3p來抑制MAPK6磷酸化，從而抑制軟骨細胞退化。山奈酚是一種存在于綠茶、漿果及一些中草藥中的膳食類黃酮[11]，能抑制TNF、IL-1、IL-6基因表達和對應炎癥因子分泌[12]。

對于靶點的分析表明，MAPK1、AKT1、APP、HRAS、MAPK8、IL-6、KNG1、VEGFA、HSP90AA1、JUN、TNF、MAPK14、IL-2、EGFR、F2等15個靶點為補腎壯筋湯治療KOA的關鍵靶點。而靶點基因富集分析結果表明，MAPK1、AKT1、HRAS都與PI3K-AKT和MAPK這2條關鍵信號通路有關。MAPK1參與多種細胞過程，如增殖、分化和凋亡等。相關研究顯示，增加MAPK1的表達，可減弱IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥損傷[13]。AKT在轉化生長因子β的調控下可發生磷酸化，誘導組織金屬蛋白酶抑制因子3表達，增強細胞外基質強度[14]。HRAS是RAS基因家族成員之一，負責調控細胞的生長與分裂[15]。HRAS多見于癌癥研究當中[16]，其在KOA中作用的報道較少。Lü等[17]在輕度的OA組織中觀察到HRAS表達下調，以及Ⅱ型膠原蛋白和MMP-13表達下調。Jiang等[18]的研究結果顯示，HRAS敲減可減弱miR-218-5p抑制對TNF誘導的軟骨細胞功能障礙的保護作用。因此，后續的相關研究可基于MAPK1、AKT1等核心靶點進行實驗設計，也可將HRAS作為研究補腎壯筋湯治療KOA細胞機制的新方向。

本次研究中對靶點基因的富集分析結果發現，補腎壯筋湯治療KOA的大部分關鍵靶點與PI3K-AKT信號通路和MAPK信號通路有關。PI3K-AKT信號通路主要參與細胞增殖、凋亡以及分化，目前也被認為是調控軟骨細胞凋亡的最重要的信號通路之一。PI3K被激活后產生磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸，后者與細胞內AKT結合后促使下游因子磷酸化，調節細胞功能[19]。顏春魯等[20]研究發現，右歸丸能有效抑制KOA模型大鼠軟骨組織中PI3K、pAKT等相關蛋白表達，促進細胞自噬以阻止軟骨細胞進一步退化；同時還發現，右歸丸能通過調控PI3K-AKT信號通路來抑制KOA患者的炎癥反應及軟骨細胞外基質的過度降解，從而延緩關節軟骨退變。MAPK廣泛存在于真核細胞當中[21]，作為MAPK信號通路三大亞類之一的p38MAPK信號通路，與KOA的病情進展關系密切。謝文鵬等[22]通過動物實驗發現，存在炎癥的軟骨基質中，p38MAPK通路中的TNF、IL-1β等炎癥因子的分泌可被蒼膝通痹膠囊抑制，同時該藥還抑制了MMP-3、MMP-13的表達，進而抑制Ⅱ型膠原蛋白的降解以保護關節軟骨。

本研究的結果提示，補腎壯筋湯治療KOA的作用機制可能是通過漢黃芩素、啤酒甾醇、槲皮素、黃芩素、山奈酚等活性成分，參與調控RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄、凋亡過程、信號傳導、細胞增殖、轉錄，影響PI3K-AKT、MAPK、TNF等信號通路。受條件限制，本研究未能將分析結果與方劑配伍、藥物配比及藥物劑量等具體問題相聯系。本研究得出的補腎壯筋湯的主要活性成分槲皮素和山奈酚，也見于其他骨科方藥的活性成分研究結果中，這可能與數據庫信息收集的局限性有關。