靈芝超微粉高效液相色譜特征指紋圖譜研究*

吳長輝

（藥用菌栽培與深加工國家地方聯合工程研發中心·福建仙芝樓生物科技有限公司，福建 福州 350001）

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝Ganoderma sinenseZhao.Xu et Zhang的干燥子實體［1］。藥理學研究表明，靈芝具有調節免疫、保肝、抗腫瘤、抗衰老、提高機體耐缺氧能力等活性［2］。靈芝傳統用法為切厚片［3］，以水煎煮后服用，由于其纖維性強，水溶性浸出物僅約4%，有效成分利用率低。為提高靈芝的利用率，可將其制成300目的超微粉［4］，但靈芝經超微粉碎后，原有性狀被破壞，建立有效的鑒別方法尤其重要。中藥特征圖譜為多指標質量控制模式，可較全面地反映化學成分的種類和數量，從而較全面、綜合地體現中藥質量［5］，其中以高效液相色譜（HPLC）法應用較廣［6］。靈芝含豐富的三萜類成分，特征較明顯［7-8］。故本研究中建立了靈芝超微粉的HPLC特征指紋圖譜，以為其質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

R205型旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）；UV2450型紫外-可見分光光度計、LC20A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；TDL-40B型離心機（上海安亭科學儀器有限公司）；XS05型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）；SK1200型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

靈芝超微粉（福建仙芝樓生物科技有限公司，批號見表1）；靈芝酸A對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為F6MX-ZHS2，含量≥95.0%）；靈芝酸C2對照品（批號為160305，含量≥98.0%）、靈芝酸F對照品（批號為160308，含量≥98.0%），均購自中國醫學科學院藥物研究所；乙腈、甲醇均為色譜純，乙酸乙酯、甲酸均為分析純，水為純化水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-乙腈（B）-0.04%甲酸水溶液（C），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：40℃；進樣量：20 μL。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution procedure of mobile phase

2.2 溶液制備

取靈芝酸A，C2，F對照品各5 mg，精密稱定，分別加甲醇溶解并定容至10 mL；分別取1 mL，置10 mL容量瓶中，加用甲醇定容，搖勻，即得對照品溶液。取樣品約1 g，精密稱定，加乙酸乙酯50 mL，超聲（功率50 W，頻率53 Hz）提取30 min，濾過、蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗：取樣品（編號為S11）適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，以靈芝酸A峰為參照峰，計算主成分峰的相對保留時間及相對峰面積。結果主成分峰相對保留時間的RSD均小于0.4%，相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取2.2項下供試品溶液（編號為S11）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，以靈芝酸A峰為參照峰，計算主成分峰的相對保留時間及相對峰面積。結果主成分峰相對保留時間的RSD均小于0.1%，主成分峰相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（編號為S11）適量，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定。以靈芝酸A峰為參照峰，計算主成分峰的相對保留時間及相對峰面積。結果主成分峰相對保留時間的RSD均小于0.3%，主成分峰相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與相似度評價

指紋圖譜建立：取11批樣品各適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，將11批樣品的HPLC數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723版），得11批樣品的HPLC疊加指紋圖譜（圖1），設S1樣品圖譜為參照，其他樣品色譜峰與參照圖譜進行自動匹配，即得樣品共有模式的對照指紋圖譜（圖2），結果共確定11個共有峰。通過與對照品圖譜（圖3）的比對，確認2號峰為靈芝酸C2，6號峰為靈芝酸A，9號峰為靈芝酸F。共有峰的相對保留時間及相對峰面積見表3、表4。

表3 11批樣品高效液相色譜圖共有峰相對保留時間Tab.3 Relative retention time of HPLC common peaks of 11 batches of samples

表4 11批樣品高效液相色譜圖共有峰的相對峰面積Tab.4 Relative peak areas of HPLC common peaks of 11 batches of samples

圖1 11批樣品高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprinst of 11 batches of samples

圖2 樣品高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of samples

圖3 對照品高效液相色譜圖2.Ganoderic acid C2 6.Ganoderic acid A 9.Ganoderic acid FFig.3 HPLC chromatograms of reference substances

相似度評價：以共有模式為對照圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723版本）軟件計算11批樣品的相似度。結果相似度均大于0.94，詳見表5。

表5 11批樣品相似度評價結果Tab.5 Similarity evaluation results of 11 batches of samples

3 討論

預試驗中比較了甲醇、乙醇和乙酸乙酯做提取溶劑時對結果的影響。結果采用前兩種溶劑提取時，供試品溶液色譜圖中前15 min的雜峰較多，而用乙酸乙酯提取的效果較好。因柱溫對分離效果影響較大［9-11］，預試驗中對35℃和40℃柱溫進行了對比研究，采用35℃時，色譜圖中25～40 min之間的色譜峰分離較差，而40℃時，各個色譜峰分離效果相對較好。對供試品溶液進行190～800 nm全波長掃描［12-13］，多數成分在254 nm波長處有較大吸收，主要色譜峰分離較好，且基線平穩。

靈芝三萜酸類物質的檢測分析，流動相主要為甲醇、乙腈、甲酸水溶液等［4，14-15］，預試驗中考察了甲醇-0.04%甲酸水溶液、乙腈-0.04%甲酸水溶液、甲醇-乙腈-0.04%甲酸水溶液作為流動相，分別按不同的洗脫程序進行洗脫。結果甲醇-乙腈-0.04%甲酸水溶液三元梯度洗脫的效果較好。

本研究中收集了11個批次的靈芝超微粉，采用HPLC法進行了特征指紋圖譜研究。由色譜圖可見，各批次樣品的色譜圖整體具有一定的相似性，主成分峰特征基本一致，相對保留時間的RSD值均小于2.0%。由相對峰面積計算結果可見，部分色譜峰的相對峰面積差異較大，表明所含成分含量差異較大。

綜上所述，本研究中所建HPLC指紋圖譜可為靈芝超微粉的真偽鑒別和質量評價提供參考。