殼寡糖修飾鹽酸川芎嗪PLGA微球體外評價*

吳鑠珺，王曙東，蘇 華，劉文雅

（中國人民解放軍東部戰區總醫院藥劑科，江蘇 南京 210012）

川芎嗪是中藥川芎的主要有效成分，可有效抑制 肺癌細胞、乳腺癌細胞等多種腫瘤細胞的增殖與遷移，誘導凋亡和自噬［1-2］。川芎嗪主要以鹽酸川芎嗪（LTH）和磷酸川芎嗪形式存在，其分子中的甲基易被氧化代謝，存在代謝快、半衰期短、生物利用度低等缺點，臨床使用須頻繁給藥，易致蓄積性中毒。將其制成緩釋制劑，有利于提高療效及降低毒副作用［3］。查閱文獻發現，利用MCF-7及A549細胞培養模型，可檢測川芎嗪納米粒的細胞毒性。細胞攝取試驗結果表明，修飾后的主動靶向納米粒的攝取量、熒光強度均顯著高于川芎嗪溶液［4］。為此，本研究中以聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為載體材料，制備殼寡糖修飾的鹽酸川芎嗪緩釋微球（COS-LTH-MS）并進行體外評價，旨在為中藥抗腫瘤制劑的開發提供實驗室數據。現報道如下。

1 儀器、試藥與細胞［5］

1.1 儀器

ER-182A型電子分析天平（日本A&D公司）；Waters 1525型高效液相色譜儀，含717型自動進樣器、2487型紫外檢測器、Waters Empower色譜軟件（美國Waters公司）；Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo公司）；85-2型溫控磁力攪拌器（江蘇金怡儀器科技有限公司）；SM-650D型超聲波細胞粉碎機（南京貝帝實驗儀器有限公司）；TM3000型臺式掃描電鏡（上海辛茨精密儀器有限公司）；ZS90型納米粒徑測定儀（廈門億恩達科技有限公司）；Eppendorf 5427型低速離心機（北京欣興強森生物科技有限公司）；Bio-Rad iMark酶標儀（上海麥莎生物科技有限公司）；Thermo CO2培養箱（賽默飛世爾科技<中國>有限公司）；TCS SP2型激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 試藥

鹽酸川芎嗪原料藥（北京燕京藥業有限公司，批號為180605）；鹽酸川芎嗪對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110817-200305，含量98%）；聚乙烯醇（PVA，上海五四試劑廠，批號為181022）；PLGA（濟南岱罡生物工程有限公司，批號為181115）；殼寡糖（COS，青島博智匯力生物科技有限公司，批號為190103）；2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES，愛爾蘭Megazyme公司，批號為181025）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC，批號為800107）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，批號為A1016），均購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養基（批號為30030）、胎牛血清（FBS，批號為11012），均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所，批號為CK04）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 細胞

人乳腺癌MCF-7細胞株、人肺腺癌A549細胞株，均由美國菌種保藏中心（ATCC）提供。

2 方法與結果

2.1 COS-LTH-MS制備

采用復乳-溶劑揮發法［6］。稱取PLGA約200 mg，溶于5 mL乙酸乙酯-二氯甲烷（3∶2，V/V）的混合溶液中，作為有機相，備用。取鹽酸川芎嗪150 mg，精密稱定，溶于5 mL水中，取0.5 mL作為內水相，緩慢加入有機相中，冰浴下超聲（功率250 W，頻率40 Hz，下同）處理形成油包水（W/O）的初乳，緩慢傾入10 mL的1%PVA溶液中，超聲處理10 min形成復乳（W/O/W），傾入15 mL的1%PVA溶液中，磁力攪拌4 h，使有機溶劑揮發，高速離心，收集固化的微球［7］，用水洗滌3遍，冷凍干燥［8］，得到鹽酸川芎嗪微球（LTH-MS），分散于適量MES緩沖液（pH 5.0）中，加入35 mg EDC和15 mg NHS活化，將上述殼寡糖溶液加入上述反應體系中，室溫下攪拌48 h，離心分離后冷凍干燥，得COS-LTH-MS［5］。初步檢測，該微球表面形態光滑圓整、尺寸可控；載藥量達19.05%，包封率為68.16%，體外釋放24 h達到平穩狀態，累積釋放量78.23%，顯示出一定的緩釋特性。

2.2 微球體外靶向性考察

2.2.1 細胞毒性

采用CCK-8法。取對數生長期的MCF-7和A549細胞（1×104個），用胰酶消化后進行細胞計數，鋪入96孔板中培養。分為實驗組［0.014，0.028，0.056，0.112，0.224，0.448 mg/mL的COS-LTH-MS（載藥量為20.02%）］、對照組（相應質量濃度的空白微球）及空白組（培養基），各設3個平行孔，進行24 h常規培養［9］。實驗當天，換無血清培養液，加1%牛血清蛋白（BSA），各組給予相應微球或培養基處理［5］。作用24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續培養4 h后測定其在450 nm波長處的吸光度（OD）值［5］。細胞生長率=實驗組OD值/空白組OD值×100%。

給藥24 h后，空白微球在給藥濃度范圍內對MCF-7和A549細胞基本無毒性。當0.056 mg/mL COS-LTH-MS作用24 h后，MCF-7和A549細胞生長率均在95%以上（圖1），表明0.056 mg/mL為COS-LTH-MS的細胞低毒性質量濃度。故選擇此質量濃度作為后續試驗的給藥濃度。

圖1 細胞毒性試驗結果A.Control group B.Test groupFig.1 Results of the cytotoxicity test

2.2.2 細胞內LTH質量濃度

取對數生長期的MCF-7和A549細胞（1×106個），分別接種于T75培養瓶中，分為LTH溶液組、LTH-MS組和COS-LTH-MS組，均分別作用1，2，8，12，24 h后，細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，用胰酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞并加甲醇100 μL，-80℃反復凍融3次，使細胞破碎。高速離心后收集上清液，檢測細胞內LTH含量。

采用高效液相色譜（HPLC）法測定LTH含量。色譜條件［10-11］：色譜柱為Sepax GP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為水-甲醇（52∶48，V/V），流速為1 mL/min，檢測波長為290 mm，柱溫為35℃，進樣量為10 μL。LTH出峰時間約為9 min，峰形良好，陰性對照無干擾；成功建立LTH質量濃度線性方程；精密度、穩定性、重復性試驗結果的RSD均小于2.0%；平均加樣回收率為98.72%，RSD為1.04%（n=9）。

結果表明，隨給藥時間的延長，A549細胞和MCF-7細胞內藥物質量濃度逐漸升高，體現出一定的濃度依賴性。修飾后的微球由于PLGA外層包裹殼寡糖，藥物須經殼寡糖緩慢降解后釋放，給藥12 h后，細胞內藥物質量濃度達到飽和。2種細胞內LTH質量濃度變化情況見表1和表2。可見，經殼寡糖修飾后的微球能將LTH更多地靶向腫瘤細胞中，且MCF-7較A549細胞更明顯。

表1 A549細胞內川芎嗪質量濃度（±s，μg/mL）Tab.1 Mass concentration of ligustrazine in A549 cells（±s，μg/mL）

表1 A549細胞內川芎嗪質量濃度（±s，μg/mL）Tab.1 Mass concentration of ligustrazine in A549 cells（±s，μg/mL）

注：與LTH溶液組比較，*P<0.05，**P<0.01；與LTH-MS組比較，#P<0.05，##P<0.01。表2同。Note：Compared with those in the LTH solution group，*P<0.05，**P<0.01；Compared with those in the LTH-MS group，#P<0.05，##P<0.01（for Tab.1-2）.

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表2 MCF-7細胞內鹽酸川芎嗪質量濃度（±s，μg/mL）Tab.2 Mass concentration of ligustrazine hydrochloride in MCF-7 cells（±s，μg/mL）

表2 MCF-7細胞內鹽酸川芎嗪質量濃度（±s，μg/mL）Tab.2 Mass concentration of ligustrazine hydrochloride in MCF-7 cells（±s，μg/mL）

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2.2.3 細胞對微球的攝取

采用激光共聚焦顯微鏡觀察。取對數生長期的MCF-7及A549細胞（1×104個），分別接種于共聚焦專用培養皿（直徑60 mm），分組同2.2.2項，分別加藥干預12 h。棄去培養基，PBS洗滌3次。設置發射光波長為526 nm，激發光波長為488 nm，置激光共聚焦顯微鏡下觀察。可見LTH溶液組自發綠色熒光，COS-LTH-MS組的熒光強度顯著高于LTH-MS組和LTH組，MCF-7細胞較A549細胞熒光強度更大，詳見圖2。推測可能是經修飾的川芎嗪微球與MCF-7細胞特定的配體結合，進入靶向部位，使MCF-7細胞內熒光較明顯。

圖2 激光共聚焦熒光強度圖（×40）A1，B1.LTH solution group A2，B2.LTH-MS group A3，B3.COS-LTH-MS groupA.A549 cells B.MCF-7 cellsFig.2 Fluorescence intensity spectra of laser-scanning confocal microscopy（×40）

3 討論

新型藥物載體系統多有緩釋性和靶向性的特點，微球也不例外。高分子化合物均有良好的生物相容性和可降解性，PLGA是應用和研究較廣泛的載體材料之一［12］。為提高LTH的生物利用度，增強療效，將其制備成PLGA緩釋微球。由于川芎嗪是水溶性藥物，藥物黏附在微球表面，微球在釋放介質中溶脹后經孔道釋放的速度較快，釋放初期藥物存在突釋，可能導致血藥濃度高于治療濃度［13］，迫切需要解決。本研究中是采用EDC和NHS活化，將PLGA的羧基端與殼寡糖的游離氨基共價連接，制得殼寡糖修飾的鹽酸川芎嗪PLGA微球［5］。體外釋藥實驗表明，修飾后的微球由于PLGA外層包裹殼寡糖，藥物須經殼寡糖緩慢降解后釋放，突釋效應減小，為水溶性中藥緩釋制劑的研究提供了參考［5］。

殼寡糖為帶正電荷的陽離子堿性低聚糖，具有吸收能力強、生物活性高等優點，同時具備調節免疫、抗腫瘤等生理活性［14-15］。由于其相對分子質量小，易進入細胞，負載的藥物可通過受體結合機制和靜電吸附作用轉移到腫瘤細胞中，從而增加細胞內藥物濃度，增強抗腫瘤作用。體外細胞試驗也證實，修飾微球的攝入量明顯優于未修飾微球，說明殼寡糖修飾微球對腫瘤細胞具有更強的靶向性。未經修飾的微球缺少主動靶向性，在體外細胞試驗中其作用明顯低于鹽酸川芎嗪原料藥，推測可能是因有特定的配體與靶細胞的受體結合，細胞表面凹陷，形成內涵體，內涵體在細胞內酸化破裂而釋藥，或因細胞攝取機制等原因，改變未經修飾的微球在體內的自然分布，從而到達特定的靶向部位，亦可將藥物修飾成前體藥物，在藥理學惰性物質的活性部位被激活，特別是靶功能被激活發揮作用，但明確的機制還有待進一步研究［5］，下一步還將進行體內實驗，并考察其在體內的組織分布等情況。制備鹽酸川芎嗪靶向微球，可提高腫瘤細胞內藥物質量濃度，減緩釋放速度，增強靶向作用，應用于抗腫瘤前景良好。