穿心蓮內(nèi)酯包合物微針的物理性狀及肺靶向性研究*

鄒清華，李?yuàn)檴櫍?翔，張 梅，丁志英，閆薈羽

（1.吉林省公主嶺市疾病預(yù)防控制中心，吉林 長(zhǎng)春 136100；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021）

穿心蓮為爵床科植物，性寒，味苦，有清熱解毒功效，歸心、肺、大腸和膀胱經(jīng)，在我國(guó)藥用歷史悠久，主治風(fēng)熱感冒、肺熱咳嗽、百日咳、咽喉腫痛、泄瀉痢疾和濕熱黃疸等疾病［1-2］。穿心蓮內(nèi)酯為穿心蓮的主要藥效成分，為二萜內(nèi)酯類化合物，對(duì)肺癌療效較好［3-4］。病理學(xué)研究顯示［5］，中高劑量的穿心蓮內(nèi)酯可明顯減輕模型大鼠肺組織病理?yè)p傷及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。但穿心蓮內(nèi)酯味極苦，幾乎不溶于水，口服生物利用度極差（僅為0.98%）［6］，應(yīng)用受限。近年來(lái)，有學(xué)者研究穿心蓮內(nèi)酯納米遞藥新技術(shù)，以提高生物利用度［7］。經(jīng)皮給藥使用方便，可隨時(shí)中斷給藥，還可避免口服給藥的首過(guò)效應(yīng)和注射給藥的風(fēng)險(xiǎn)，受到患者的青睞。經(jīng)皮水凝膠［8］和納米遞藥系統(tǒng)經(jīng)皮給藥［9-13］被發(fā)現(xiàn)可用于癌癥等疾病的全身治療［14］。但因皮膚角質(zhì)層是經(jīng)皮給藥的主要吸收屏障［15-16］，跨過(guò)屏障的藥量仍有限。微針是指微米級(jí)長(zhǎng)度和微米級(jí)間距的陣列，具有一定的硬度，可以刺破皮膚角質(zhì)層，攜帶藥物進(jìn)入真皮層，隨血液和淋巴循環(huán)，達(dá)到治療全身疾病的目的［17-20］。本研究中設(shè)計(jì)研制了穿心蓮內(nèi)酯包合物微針，并與穿心蓮內(nèi)酯滴丸進(jìn)行對(duì)比，研究藥物代謝動(dòng)力學(xué)（簡(jiǎn)稱藥動(dòng)學(xué)）特點(diǎn)及肺靶向性，為穿心蓮內(nèi)酯的經(jīng)皮給藥提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

1.1 儀器

A25 PDMS型微針模具（臺(tái)州微芯醫(yī)藥科技有限公司）；CX21型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；TDL-5A型

冷凍離心機(jī)（中國(guó)新寶儀器有限公司）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）。

1.2 試藥

穿心蓮內(nèi)酯滴丸（天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)Z20040078，規(guī)格為每袋含穿心蓮內(nèi)酯0.15 g）穿心蓮內(nèi)酯（四川廣漢市維康植化有限公司，批號(hào)為080220，含量99.3%）；羥丙基-β環(huán)糊精（山東新大生物科技有限公司，批號(hào)為150301，含量98.5%）；聚乙烯醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為2016091901，含量≥99.0%）；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD大鼠72只，雌性，體質(zhì)量（200±20）g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（吉）2016-0001。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 微針制備

采用微模塑法制備。取羥丙基-β環(huán)糊精適量，置50℃水中，恒溫?cái)嚢柚镣耆芙猓粚⒋┬纳弮?nèi)酯乙醇溶液置上述羥丙基-β環(huán)糊精溶液中，50℃恒溫?cái)嚢? h，常溫繼續(xù)攪拌5 h，靜置，冷藏12 h，抽濾，用少量乙醇洗滌濾膜，得穿心蓮內(nèi)酯羥丙基-β環(huán)糊精包合物，備用。以質(zhì)量比為3∶1的聚乙烯醇與透明質(zhì)酸鈉制備微針載體材料溶液，加入穿心蓮內(nèi)酯包合物水溶液，混勻，澆鑄于PDMS模具上，成型后加入背襯溶液，抽真空10 min，干燥，脫模，即得穿心蓮內(nèi)酯包合物微針。

2.2 微針物理性狀考察

形態(tài)：采用手機(jī)拍照和光學(xué)顯微鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1。可見(jiàn)，微針均呈“圓錐”狀，針體均勻且表面光滑平整。

圖1 微針形態(tài)a，b.Mobile camera figures c，d.MicrographsFig.1 The microneedles′shape

機(jī)械強(qiáng)度：將微針針尖朝下，置平整光滑的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，在微針背襯層上加蓋平滑的蓋板，使受力均勻。將400 g砝碼置蓋板上約90 s，取下砝碼和蓋板，再將微針置顯微鏡下，觀察針尖的變形程度。結(jié)果針長(zhǎng)675 μm及625 μm的微針，壓變后長(zhǎng)度分別為550 μm和500 μm，彎折率分別為18.52%和20.00%，詳見(jiàn)圖2。可見(jiàn)，微針具有一定的機(jī)械強(qiáng)度。

圖2 微針機(jī)械強(qiáng)度A1，B1.Before piezoelectricity A2，B2.After piezoelectricity A.675 μm needle B.625 μm needleFig.2 Mechanical strength of microneedles

穿刺性能：取大鼠離體背部皮膚，脫毛，并去除皮膚表面細(xì)絨毛。將處理好的離體皮膚平鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，角質(zhì)層向上，將微針垂直于皮膚角質(zhì)層側(cè)進(jìn)行穿刺，并使微針在皮膚上停留約3 min，取出微針，拍照，顯微圖見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，大鼠皮膚角質(zhì)層及背面可見(jiàn)清晰的針孔陣列，針孔排列與微針貼片的針尖一致，表明其穿刺角質(zhì)層的性能良好。

圖3 微針穿刺性能A.Cuticle B.Back of cuticleFig.3 Puncture ability of the microneedles

2.3 藥動(dòng)學(xué)研究

分組、給藥及取樣：取72只SD大鼠，禁食12 h，過(guò)夜，自由飲水。實(shí)驗(yàn)前，剃除大鼠背部大部分毛，并除去短毛，隨機(jī)分為對(duì)照組和微針組，各36只。對(duì)照組大鼠灌胃給予穿心蓮內(nèi)酯滴丸溶液，微針組大鼠腹部皮膚表面貼微針，穿心蓮內(nèi)酯含量均為0.000 9 mg/kg，分別于給藥后0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10，12，24 h眼球取血，置EP管中，于-4℃，15 000 r/min冷凍離心15 min，取上清液，置EP管中，置-40℃冰箱中凍存。取血后立即處死大鼠，取肺、心、脾及腦組織，用適量生理鹽水洗去血跡，置-40℃冰箱中凍存，備用。

血藥濃度-時(shí)間曲線：取大鼠血漿1 mL，加入甲醇1 mL，渦旋混勻1 min，15 000 r/min冷凍離心15 min，取上清液，揮干，再加1 mL甲醇復(fù)溶殘?jiān)?jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定。色譜條件，色譜柱為WondaSil C18Superb柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（60∶40，V/V），流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物濃度，并繪制血藥濃度-時(shí)間曲線。微針組經(jīng)皮給藥后不同時(shí)間的血藥濃度均明顯大于對(duì)照組，且24 h時(shí)仍能檢測(cè)出藥物。結(jié)果見(jiàn)圖4。可見(jiàn)，微針組大鼠體循環(huán)中穿心蓮內(nèi)酯藥量多于對(duì)照組。

圖4 血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.4 Drug′s plasma concentration-time curve

各組織中的藥物濃度-時(shí)間關(guān)系：取備用的各組織適量，精密稱定，剪碎，置EP管中，加入1 mL甲醇，渦旋1 min，15 000 r/min離心15 min，取上清液揮干，加1 mL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，用HPLC法測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組織中不同時(shí)間的藥物濃度，詳見(jiàn)圖5。可見(jiàn)，微針組給藥后不同時(shí)間肺、心、脾組織中的藥物濃度總體明顯高于對(duì)照組，尤其是肺中藥物濃度增加非常明顯，推測(cè)可能是由于穿心蓮歸肺經(jīng)，故穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)入體內(nèi)后，具有明顯的肺靶向性。

圖5 不同臟器中藥物濃度-時(shí)間關(guān)系A(chǔ).Lung B.Heart C.Spleen D.BrainFig.5 Drug′s concentration-time relationship in different organs

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)：采用DAS 3.0軟件，根據(jù)不同時(shí)間的血漿和組織中藥物濃度計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn)，微針經(jīng)皮給藥后，血藥濃度達(dá)峰時(shí)間（tmax）及起效時(shí)間縮短；峰濃度（Cmax）和藥-時(shí)曲線下面積（AUC）明顯增大，表明體循環(huán)中藥量增多。

表1 兩組藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較Tab.1 Comparison of pharmacokinetic parameters between the two groups

靶向性：通常用相對(duì)靶向效率（RTE）評(píng)價(jià)藥物制劑的靶向性，計(jì)算公式為，RTE=AUC微針組/AUC對(duì)照組。RTE代表不同制劑對(duì)同一組織或器官的選擇性，RTE>1時(shí)，表示藥物制劑對(duì)該器官或組織具有靶向性，且越大，靶向效果越好；RTE≤1時(shí)，表示無(wú)靶向性。結(jié)果顯示，肺、心、脾、腦的RTE分別為20.46，1.49，2.10，0.60。可見(jiàn)，穿心蓮內(nèi)酯包合物微針經(jīng)皮給藥具有非常明顯的肺靶向性，心、脾雖也有一定靶向效率，但靶向性不強(qiáng)。

3 討論

肺癌已成為最常見(jiàn)惡性腫瘤，近年來(lái)全球的發(fā)病率和死亡率激增，在我國(guó)惡性腫瘤死亡原因中排首位。本研究中通過(guò)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，計(jì)算肺靶向效率，間接反映了穿心蓮內(nèi)酯包合物微針經(jīng)皮給藥的肺靶向性，推測(cè)可能與穿心蓮藥材歸肺經(jīng)相關(guān)。通常采用藥劑學(xué)的磁性靶向、光熱靶向或生理靶向等方法，可達(dá)到化學(xué)藥物肺靶向的目的。

微針經(jīng)皮給藥能克服皮膚角質(zhì)層的屏障而達(dá)到全身治療的目的，同時(shí)避免口服給藥的首過(guò)效應(yīng)和注射給藥的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)中采用微模塑法，成功制備了穿心蓮內(nèi)酯包合物微針，方法簡(jiǎn)單，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。

穿心蓮內(nèi)酯包合物微針給藥，增加了藥物的溶解性。微針給藥后的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯包合物微針很好地克服了經(jīng)皮給藥的角質(zhì)層屏障，既可避免口服的不良味道，又能明顯增加進(jìn)入體循環(huán)的藥量；同時(shí)，穿心蓮歸肺經(jīng)，研究顯示其具有較好的肺靶向性。

微針技術(shù)的臨床前試驗(yàn)，成功凸顯了微針改變?nèi)蚪?jīng)皮給藥市場(chǎng)的潛力，商用微針產(chǎn)品備受期待，它將可能隨著從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模擴(kuò)大到工業(yè)規(guī)模，對(duì)臨床醫(yī)學(xué)產(chǎn)生顯著影響［17］。

注：所有作者均聲明不存在利益沖突。