超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法分析金水六君煎化學(xué)成分*

李紅亮，金思岑

（重慶太極實(shí)業(yè)<集團(tuán)>股份有限公司，重慶 401123）

金水六君煎見于明代張介賓的《景岳全書》，被列為國家中醫(yī)藥管理局協(xié)同國家藥品監(jiān)督管理局公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》第58首［1］，由當(dāng)歸、熟地黃、陳皮、半夏、茯苓、炙甘草、生姜7味藥材組方，主治肺腎虛寒、水泛為痰，或年邁陰虛、血?dú)獠蛔恪⑼馐茱L(fēng)寒、咳嗽嘔惡、喘逆多痰等癥［2］。近年來對該方的藥效學(xué)研究較多，但對其化學(xué)成分的研究僅停留在單個或多個成分的含量測定方法及多成分的高效液相色譜指紋圖譜研究［3-5］，而經(jīng)典名方中物質(zhì)組分的全面分析是制訂其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)［6］。為更好地控制金水六君煎的質(zhì)量，需對其化學(xué)成分進(jìn)行全面研究。超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）法能快速識別中藥復(fù)方中的化學(xué)成分，且分辨率和靈敏度均較高，廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的組分分析［7-8］。本研究中建立了分析金水六君煎中主要化學(xué)成分的UPLC-Q-Orbitrap HRMS法，進(jìn)一步明確了該煎劑的物質(zhì)基礎(chǔ)，為后續(xù)的質(zhì)量屬性研究提供了數(shù)據(jù)支持。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Vanquish型UPLC-Q-Orbitrap HRMS儀（美 國Thermo Scientific公司）；XSE205DU型十萬分之一電子天平、AE240型萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500DE型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

金水六君煎（公司自制）；甘草苷對照品（批號為111610-201908，含量95.0%），橙皮苷對照品（批號為110721-201818，含量96.2%），柚皮苷對照品（批號為110722-201815，含量91.7%），6-姜辣素對照品（批號為111833-201806，含量93.6%），腺苷對照品（批號為110879-201703，含量99.7%），藁本內(nèi)酯對照品（批號為111737-201910），阿魏酸對照品（批號為110773-201614，含量99.0%），異阿魏酸對照品（批號為111698-201904，含量99.3%），濱蒿內(nèi)酯對照品（批號為111511-201704，含量99.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；異甘草苷對照品（成都昂賽思生物科技有限公司，批號為5041-81-6，含量≥98.0%）；洋川芎內(nèi)酯A對照品（成都普菲生物技術(shù)有限公司，批號為17051901，含量≥98.0%）。乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為ThermoScientificAccucoreTMC18柱（100 mm×3 mm，2.6 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～23 min時30%B→95%B，23～25 min時95%B，25～30 min時95%B→30%B）；流速為0.3 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為3 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式為正、負(fù)離子全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級掃描（Full MS/dd-MS2）；離子源溫度為350℃；鞘氣為氮?dú)猓魉贋?5 arb；輔助氣為氮?dú)猓魉贋?0 arb；離子傳輸管溫度為320℃；噴霧電壓為3.2 kV。一級質(zhì)譜掃描分辨率［以半峰全寬（FWHM）計］為70 000 FWHM；二級分辨率為17 500 FWHM；掃描范圍質(zhì)荷比（m/z）100～1 500；碰撞能量梯度為20，40，60 eV。

2.2 溶液制備

取甘草苷、異甘草苷、橙皮苷、柚皮苷、6-姜辣素、腺苷、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、異阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、濱蒿內(nèi)酯對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成上述成分質(zhì)量 濃 度 分 別 為11.5，10.3，11.2，10.2，10.3，10.1，51.2，10.4，9.7，50.7，50.5 μg/mL的混合對照品溶液。取樣品5 mL，減壓回收溶劑，蒸干，加水20 mL，溶解，加40 mL乙酸乙酯萃取1次，回收溶劑，加甲醇溶解，置5 mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 檢測結(jié)果

取2.2項(xiàng)下2種溶液各適量，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖（見圖1），總離子流圖（TIC）見圖2。利用Compound Discoverer 3.0軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對齊和峰提取，通過與mzCloud質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及mzVault網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，并與相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行對比以及與對照品進(jìn)行確認(rèn)，共鑒定63個化學(xué)成分，包括黃酮類22個、生物堿類9個、內(nèi)酯類6個、芳香族類6個、有機(jī)酸類5個、香豆素類3個、氨基酸類4個、核苷酸類2個、糖類2個及其他類4個。具體成分信息見表1。

表1 金水六君煎化學(xué)成分信息Tab.1 Characterization of chemical components of Jinshuiliujun Decoction

圖1 高效液相色譜圖1.Adenosine 2.Ferulic acid 3.Liquiritin 4.Naringin 5.Isoferulic acid 6.Hesperidin 7.Isoliquiritin 8.Scoparone 9.Ligustrolide A 10.6-Gingerol 11.Ligustilide A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

圖2 總離子流圖A.Positive ion B.Negative ionFig.2 Total ion flow chromatogram

續(xù)表1金水六君煎化學(xué)成分信息Continued Tab.1 Characterization of chemical components of Jinshuiliujun Decoction

2.4 成分鑒定與分析

黃酮類化合物：共鑒定出22種，分別為化合物17～18，22～23，27～29，31～34，36，38～39，41，45，47～48，54，56，58，61。以化合物29橙皮苷為例，根據(jù)保留時間10.32 min，及在正離子模式下一級質(zhì)譜信息中其準(zhǔn)分子離子峰的m/z611.197 33，推測其分子式為C28H34O15；進(jìn)一步進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，根據(jù)碎片離子峰（1）的m/z303.086 40，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失C12H20O9形成的碎片；根據(jù)碎片離子峰（2）m/z177.054 82和（3）m/z153.018 40，分析其為碎片離子峰（1）裂解形成的2個碎片離子峰。根據(jù)其二級質(zhì)譜裂解方式，檢索mzCloud和mzVault網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，推測為橙皮苷，最后經(jīng)與對照品比對確定。質(zhì)譜裂解途徑見圖3。

圖3 橙皮苷質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 MS fragmentation pathway of hesperdin

生物堿類化合物：共鑒定出9種，分別為化合物2～3，7，9，12，14，44，62～63。以化合物9煙堿為例，根據(jù)保留時間2.75 min，及正離子模式下一級質(zhì)譜信息中其準(zhǔn)分子離子峰的m/z123.055 63，推測其分子式為C6H6N2O；進(jìn)一步進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，根據(jù)碎片離子峰（1）的m/z106.029 47，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失—NH3形成的碎片；根據(jù)碎片離子峰（2）的m/z78.034 72，分析其為碎片離子峰（1）丟失—CO—形成的碎片。根據(jù)其二級質(zhì)譜裂解方式，檢索mzCloud和mzVault網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，推測為煙堿。質(zhì)譜裂解途徑見圖4。

圖4 煙堿質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 MS fragmentation pathway of nicotinic

內(nèi)酯類化合物：共鑒定出6種，分別為化合物20，40，49～51，57。以化合物20黑麥草內(nèi)酯為例，根據(jù)保留時間9.61 min，及正離子模式下一級質(zhì)譜信息中其準(zhǔn)分子離子峰的m/z197.117 65，推測其分子式為C11H16O3；進(jìn)一步進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，根據(jù)碎片離子峰（1）的m/z179.106 86，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失H2O后形成的碎片；根據(jù)碎片離子峰（2）的m/z161.096 24，分析其為由碎片離子峰（1）丟失H2O形成的碎片；根據(jù)碎片離子峰（3）的m/z133.101 41，分析其為碎片離子峰（2）丟失—CO—形成的碎片。根據(jù)其二級質(zhì)譜裂解方式，檢索mzCloud和mzVault網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，推測為黑麥草內(nèi)酯。質(zhì)譜裂解途徑見圖5。

圖5 黑麥草內(nèi)酯質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 MS fragmentation pathway of loliolide

香豆素類化合物：共鑒定出3種，分別為化合物16，26，42。以化合物26濱蒿內(nèi)酯為例，根據(jù)保留時間10.07 min，及在正離子模式下一級質(zhì)譜信息中其準(zhǔn)分子離子峰的m/z207.065 19，推測其分子式為C11H10O4；進(jìn)一步進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，根據(jù)碎片離子峰（1）的m/z192.041 72，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失—CH3形成的碎片；根據(jù)碎片離子峰（2）的m/z179.040 16，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失—CO—形成的碎片；根據(jù)碎片離子峰（3）的m/z151.075 36，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失2個—CO—形成的碎片。根據(jù)其二級質(zhì)譜裂解方式，檢索mzCloud和mzVault網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，推測為濱蒿內(nèi)酯，最后經(jīng)與對照品比對確定。質(zhì)譜裂解途徑見圖6。

圖6 濱蒿內(nèi)酯質(zhì)譜裂解途徑Fig.6 MS fragmentation pathway of scoparone

芳香族類化合物：共鑒定出6種，分別為化合物13，30，46，55，59～60。以化合物55（4-甲氧基苯甲醛）為例，根據(jù)保留時間18.89 min，及在正離子模式下一級質(zhì)譜信息中其準(zhǔn)分子離子峰的m/z137.059 84，推測其分子式為C8H8O2；進(jìn)一步進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，根據(jù)碎片離子峰（1）的m/z122.036 51，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失—CH3形成的碎片；根據(jù)碎片離子峰（2）的m/z94.04186，分析其為碎片離子（1）丟失—CO—形成的碎片。根據(jù)其二級質(zhì)譜裂解方式，檢索mzCloud和mzVault網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，推測為4-甲氧基苯甲醛。質(zhì)譜裂解途徑見圖7。

圖7 4-甲氧基苯甲醛質(zhì)譜裂解途徑Fig.7 MS fragmentation pathway of 4-methoxy benzaldehyde

有機(jī)酸類化合物：共鑒定出5種，分別為化合物19，25，35，37，53。以化合物25阿魏酸為例，根據(jù)保留時間9.95 min及在負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜信息中其準(zhǔn)分子離子峰的m/z193.050 13，推測其分子式為C10H10O4；進(jìn)一步進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，根據(jù)碎片離子峰（1）的m/z178.026 60，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失—CH3形成的碎片；根據(jù)碎片離子峰（2）的m/z149.060 09，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失CO2后形成的碎片；根據(jù)碎片離子峰（3）的m/z134.036 48，分析其為碎片離子（2）丟失—CH3形成的碎片；根據(jù)碎片離子峰（4）的m/z123.044 78，分析其是由碎片離子（2）丟失C2H2形成的碎片。根據(jù)其二級質(zhì)譜裂解方式，檢索mzCloud和mzVault網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，推測為阿魏酸，最后經(jīng)與對照品比對確定。質(zhì)譜裂解途徑見圖8。

圖8 阿魏酸質(zhì)譜裂解途徑Fig.8 MS fragmentation pathway of ferulic acid

氨基酸類化合物：共鑒定出4種，分別為化合物1，10，15，21。以化合物1精氨酸為例，根據(jù)保留時間1.74 min及在正離子模式下一級質(zhì)譜信息中其準(zhǔn)分子離子峰的m/z175.118 90，推測其分子式為C6H14N4O2；進(jìn)一步進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，根據(jù)碎片離子峰（1）的m/z158.092 32，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失-NH3形成的碎片；根據(jù)碎片離子峰（2）的m/z130.097 6，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失—COOH后形成的碎片。根據(jù)其二級質(zhì)譜裂解方式，檢索mzCloud和mzVault網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，推測為精氨酸。質(zhì)譜裂解途徑見圖9。

圖9 精氨酸質(zhì)譜裂解途徑Fig.9 MS fragmentation pathway of arginine

核苷酸類化合物：共鑒定出2種，分別為化合物4，8。以化合物8腺苷為例，根據(jù)保留時間2.41 min，及正離子模式下一級質(zhì)譜信息中其準(zhǔn)分子離子峰的m/z268.103 91，推測其分子式為C10H13N5O4；進(jìn)一步進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，根據(jù)碎片離子峰（1）的m/z136.061 17，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失C5H8O4形成的碎片；根據(jù)碎片離子峰（2）的m/z119.035 3，分析其為碎片離子（1）丟失—NH3形成的碎片。根據(jù)其二級質(zhì)譜裂解方式，檢索mzCloud和mzVault網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，推測為腺苷，最后經(jīng)與對照品比對確定。質(zhì)譜裂解途徑見圖10。

圖10 腺苷質(zhì)譜裂解途徑Fig.10 MS fragmentation pathway of adenosine

糖類化合物：共鑒定出2種，分別為化合物5和6。以化合物6蔗糖為例，根據(jù)保留時間2.23 min，及在正離子模式下一級質(zhì)譜信息中其準(zhǔn)分子離子峰的m/z341.109 70，推測其分子式為C12H22O11；進(jìn)一步進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，根據(jù)碎片離子峰的m/z179.055 5，分析其為準(zhǔn)分子離子丟失C6H10O5形成的碎片。根據(jù)其二級質(zhì)譜裂解方式，檢索mzCloud和mzVault網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，推測為蔗糖。質(zhì)譜裂解途徑見圖11。

圖11 蔗糖質(zhì)譜裂解途徑Fig.11 MS fragmentation pathway of sucrose

其他類化合物：共鑒定出4種其他類化合物，分別為化合物11，24，43，52。

3 討論

本研究中采用了正、負(fù)離子同時掃描的方法對金水六君煎中的化合物進(jìn)行檢測，在此基礎(chǔ)上根據(jù)色譜峰分離情況優(yōu)化色譜條件及樣品提取條件，流動相考察了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液，發(fā)現(xiàn)以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液為流動相時，色譜峰分離效果較好，故選用。

本研究中鑒定出金水六君煎物質(zhì)基準(zhǔn)中63個化學(xué)成分，通過查閱文獻(xiàn)對這些成分的來源進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)黃酮類成分多來源于甘草和陳皮，生物堿類成分多來源于半夏，酚酸類成分多來源于生姜，內(nèi)酯和苯丙素類成分多來源于當(dāng)歸，氨基酸類成分多來源于半夏和茯苓。本研究中對金水六君煎的化學(xué)成分進(jìn)行了較全面的研究，為其物質(zhì)基礎(chǔ)、入血成分及其代謝物的研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究還存在一定不足，尚有很多化合物未鑒定出來，包括某些藥材的代表性成分，如熟地黃的毛蕊花糖苷、梓醇及地黃苷D等，可能是由于供試品制備時僅采用乙酸乙酯萃取，導(dǎo)致樣品中化學(xué)成分提取不完全。后續(xù)可通過優(yōu)化樣品制備條件，或采用多個不同極性的有機(jī)溶劑對樣品進(jìn)行萃取，并對每個組分都進(jìn)行鑒別。而對于其他未鑒定出的化學(xué)成分仍待更深入的研究。

本研究中有11個化學(xué)成分通過與對照品比對而準(zhǔn)確鑒定，以此為基礎(chǔ)，建立了同時測定金水六君煎中11種主要成分的UPLC法［3］，從而對金水六君煎的物質(zhì)基礎(chǔ)及現(xiàn)代制劑質(zhì)量進(jìn)行控制與評價，為相關(guān)新藥開發(fā)奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。