關節解痛膏微生物限度檢查方法學驗證

儲梅君，陳希，張銀花，鄢雷娜

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

關節解痛膏為中藥復方橡膠貼膏制劑。標準收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑（第十冊）［1］，由辣椒、細辛、白芷、姜黃、生川烏、肉桂、生草烏、骨碎補、五加皮、天南星、紅花、半夏、鬧羊花、獨活、防風、羌活、桑枝、海風藤、鳳仙透骨草、芥子、防己、伸筋草、威靈仙、顛茄流浸膏、冰片、薄荷腦、水楊酸甲酯、樟腦、麝香草酚、二甲苯麝香、鹽酸苯海拉明等三十一味藥物組成。關節解痛膏為淡黃色的片狀橡膠膏，氣芳香，有活血，止痛，祛風，除濕的功效。可用于風寒濕痹、關節痛、神經痛、肌肉酸痛、腰痛、扭傷等病癥的治療［1-3］。本研究根據該品種的用藥途徑特點以及《中國藥典》2020 年版微生物限度檢查法對其用藥途徑的有關要求［2］，對控制菌（銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌）的檢查方法進行了實驗，以建立適合于關節解痛膏的微生物限度檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AB2-4S1 型生物安全柜（新加坡藝思高科技有限公司）；MZ-601 型集菌儀（杭州美卓生物科技有限公司）；MLS-3781L-PC 型高壓蒸汽滅菌器（日本PHCbi 普和希）；HWS-250 型恒溫恒濕培養箱（天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司）；EVS2 型全封閉無菌檢驗過濾培養器（浙江泰林生物技術股份有限公司）；VITEK2compact 型自動微生物快速檢測分析系統（法國生物梅里埃公司）。

1.2 培養基及試劑

所用培養基及試劑均經過適用性試驗驗證，符合《中國藥典》2020 年版的要求，具體信息見表1。培養基均按說明書要求配制。本研究涉及的稀釋液均為pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

表1 培養基信息表

上述培養基均按說明書要求配制。本文涉及的稀釋液均為pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.3 菌種

菌種均源自中國醫學菌種保藏中心，具體信息詳見表2。試驗菌株均為第二代。

表2 菌種信息表

1.4 樣品

關節解痛膏（生產單位：江西吉安三力制藥有限公司；批號：210402；規格：7×10 cm/貼）。

2 方法與結果

2.1 方法學驗證試驗

2.1.1 菌液制備 根據《中國藥典》2020 年版四部通則1106“非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法”項下的規定［2］，制得每1 mL 含菌量分別不大于100 cfu 的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌懸液，并對所制備的菌液進行平板計數，結果見表3。

表3 菌液計數結果 CFU/mL

2.1.2 供試液制備 取樣品100 cm2，撕掉貼劑的保護層，在粘貼面上覆蓋無菌紗布，置100 mL 含1%聚山梨酯80 的稀釋液中，振搖30 min，即得1∶10 供試液。

2.2 方法適用性試驗

本品種為橡膠貼膏，根據相關標準，橡膠貼膏每10 cm2不得檢出銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

2.2.1 銅綠假單胞菌檢查方法適用性試驗 供試品陽性對照試驗：取供試液10 mL 按薄膜過濾法，加入稀釋液100 mL，濾干，再用200 mL 稀釋液沖洗（每次100 mL），在最后一次沖洗液中加入上述制備好的銅綠假單胞菌懸液。過濾后轉移濾膜接種至100 mL TSB 中，經33 ℃培養18 h 后取上述培養物劃線接種于CA 平板上，33 ℃培養24 h 后觀察結果。

陰性對照試驗：取稀釋液10 mL 按薄膜過濾法，加入稀釋液100 mL，濾干，再用200 mL 稀釋液沖洗（每次100 mL）。過濾后轉移濾膜至100 mL TSB中，經33 ℃培養24 h 后取上述培養物劃線接種于CA 平板上，33℃培養72 h 后觀察結果。

結果：供試品陽性對照試驗中CA 平板上有菌落生長，且氧化酶試驗陽性,經分離純化和VITEK2compact 型自動微生物快速檢測分析系統鑒定確證為銅綠假單胞菌；陽性對照試驗中CA 平板上無菌落生長（未檢出銅綠假單胞菌）。

樣品控制菌銅綠假單胞菌檢查采用上述薄膜過濾法時其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不計，認為方法可行。

2.2.2 金黃色葡萄球菌檢查方法適用性試驗 供試品陽性對照試驗：取供試液10 mL 按薄膜過濾法，加入100 mL 稀釋液，濾干，再用200 mL 稀釋液沖洗（每次100 mL），在最后一次沖洗液中加入上述制備好的金黃色葡萄球菌懸液。過濾后轉移濾膜接種至100 mL TSB 中，經33 ℃培養18 h 后劃線接種于MSAM 平板上，33 ℃培養24 h 后觀察結果［4-7］。

陰性對照試驗：取稀釋液10 mL 按薄膜過濾法，加入100 mL 稀釋液，濾干，再用200 mL 稀釋液沖洗（每次100 mL）。過濾后轉移濾膜接種至100 mL TSB 中，經33 ℃培養24 h 后劃線接種于MSAM 平板上，33 ℃培養72 h 后觀察結果。

結果：供試品陽性對照試驗中MSAM 平板上有黃色菌落生長，經分離純化和VITEK2compact 型自動微生物快速檢測分析系統鑒定確證為金黃色葡萄球菌；陰性對照試驗中MSAM 平板上無菌落生長（未檢出金黃色葡萄球菌）。

藥品控制菌金黃色葡萄球菌檢查采用上述薄膜過濾法時其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不計，認為方法可行。

3 討論

關節解痛膏為中藥復方橡膠貼膏制劑，其處方包含三十一味中藥，對細菌有一定的抑菌作用［8-12］。常規法往往不適用于控制菌檢查方法的驗證，需采用薄膜過濾法才可去除對細菌的抑制作用，以pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液進行沖洗，以100 mL 和300 mL 為沖洗量進行試驗，最終確定300 mL 沖洗量［13-14］。

本研究最初按照《中國藥典》2020 年版規定，采取“取供試品100 cm2，加入含10%無菌十四烷酸異丙酯的pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，45 ℃保溫振搖30 min”的方法制備1∶10 供試液,出現了水油分層不明顯的情況，經過一系列的試驗，最終將表面活性劑“10%無菌十四烷酸異丙酯”改為“1%聚山梨酯80”，供試品溶液能完全溶解，無油水分層的情況出現［15-18］。綜上所述，最后將供試液制備方法確定為“取供試品100 cm2，撕掉貼劑的保護層，在粘貼面上覆蓋無菌紗布，置100 mL pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（含1%聚山梨酯80）中，振搖30 min，作為1∶10 供試液”［19-21］。

本研究采用《中國藥典》2020 年版四部通則1106 非無菌產品微生物限度檢查中控制菌檢查法對關節解痛膏控制菌檢查方法進行研究，采用薄膜過濾法，使用300 mL 稀釋液進行沖洗，該方法可操作性強、準確性高。