丙戊酸鈉對嚴重燙傷合并海水浸泡延遲補液模型大鼠心腦損傷的保護作用Δ

孟祥熙，田雨沫，胡森，王莉莉，張慧蘋，鐘毓賢，王宏偉，丁宇（.承德醫學院附屬醫院燒傷整形科，河北 承德 067000；.解放軍總醫院醫學創新研究部創傷修復與組織再生研究中心，北京 008；.解放軍總醫院第六醫學中心中醫醫學部康復醫學科，北京 0008；.解放軍總醫院第四醫學中心病理科，北京 0007；.解放軍總醫院第六醫學中心中醫醫學部骨傷科，北京 0008）

隨著人類海洋活動的增加，海難或海戰時落海傷員常同時伴有燒傷和海水浸泡。由于海上環境特殊，醫療救助受限，往往難以及時開展有效的靜脈液體復蘇，導致傷員死亡率升高，救治難度增加[1]。若在傷后早期給予抗休克維持藥物，提高機體對休克的耐受能力，保護心腦等重要臟器功能，就能為后續救治爭取時間，從而提高傷員生存率。丙戊酸鈉是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，既往研究發現，在失血性休克或致死性燙傷動物實驗中，丙戊酸鈉能保護重要臟器功能，提高動物生存率[2－5]。因此，本研究通過構建嚴重燙傷合并海水浸泡延遲補液大鼠模型，并在燙傷后立即皮下注射大劑量丙戊酸鈉，從而探究其對大鼠損傷心腦的保護作用，以期為丙戊酸鈉用于燒傷合并海水浸泡傷員的救治提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

PowerLab型多導生理記錄儀購自澳大利亞ADInstruments公司；RAPIDPoint 500型血氣分析儀購自德國Siemens公司；KD-BM型生物組織包埋機購自金華市科迪儀器設備有限公司；CKX53型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；ST360型酶標儀購自上海科華生物工程股份有限公司；數字測溫儀購自衡水創紀儀器儀表有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

丙戊酸鈉對照品（批號B2013169，純度≥98%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；戊巴比妥鈉（批號P3761，純度≥98%）購自美國Sigma公司；乳酸鈉林格注射液（批號2010242107，規格500 mL）購自石家莊四藥有限公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB）和神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）酶聯免疫吸附測定試劑盒（批號分別為202107、202104）均購自上海江萊生物科技有限公司。

1.3 人工海水

人工海水按照國家海洋局第三海洋研究所提供的海水主要成分配制，其滲透壓為（1 250±11）mmol/L，pH為8.20，含鈉離子（630±5）mmol/L、鉀離子（10.88±0.68）mmol/L、氯離子（658.8±5.5）mmol/L，溫度為（23±1）℃。

1.4 動物

雄性SD大鼠180只，60～70日齡，體質量250～300 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，生產許可證號為SCXK（京）2019-0010。購進后，大鼠適應性飼養于22～25℃的飼養房內1周以上，自由飲食。大鼠飼養與實驗過程均嚴格遵守實驗動物管理與保護準則。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將大鼠按照隨機數字表法分為燙傷+延遲補液組（S組）、燙傷+海水浸泡+延遲補液組（SS組）、燙傷+海水浸泡+丙戊酸鈉+延遲補液組（SSV組），每組60只。術前禁食12 h、自由飲水，所有大鼠稱定體質量后給予戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，固定、消毒，解剖分離一側頸總動脈、靜脈，分別插管，剪除頸背部和臀部毛發。采用沸水水浴法建立Ⅲ度燙傷模型：將大鼠頸背部和臀部浸泡于100℃沸水中15 s造成35%總體表面積Ⅲ度燙傷，燙傷深度經病理組織切片檢查證實。SS組和SSV組大鼠燙傷后立即浸泡于人工海水中（30 min），其中SSV組出水后即刻皮下注射丙戊酸鈉300 mg/kg[6－7]。燙傷后2 h，各組按1/2 Parkland公式（4 mL×1%燒傷面積×kg）于30 min內靜脈注射乳酸鈉林格注射液進行延遲補液，在燙傷后的第1個8 h補入總量的1/2[8]。

2.2 大鼠生存情況觀察

每組取20只大鼠。S組燙傷后即刻觀察，SS組和SSV組海水浸泡后開始觀察，每30 min觀察1次，連續觀察24 h，記錄大鼠死亡時間，計算各組大鼠平均生存時間和24 h生存率。24 h生存率（%）＝（各組大鼠燙傷后24 h生存只數/各組總只數）×100%。

2.3 大鼠生命體征檢測

每組分別在燙傷前、燙傷后0 h、燙傷后2 h、燙傷后5 h這4個時間點取10只大鼠，采用多導生理記錄儀檢測大鼠的平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）、心率（heart rate，HR）、呼吸頻率（respiration rate，RR），采用數字測溫儀插入大鼠肛門10 cm處檢測其直腸溫度（rectal temperature，RT）[9]。

2.4 大鼠動脈血氣和臟器功能指標檢測

抽取“2.3”項下各組同批次大鼠4個時間點的頸動脈血，采用血氣分析儀檢測血氣分析指標，包括pH、動脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）、動脈血二氧化碳分壓（arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、實際碳酸氫根（HCO3－）；將抽取的頸動脈血離心后取血清，按照試劑盒說明書操作以酶標儀檢測血清中CK-MB、NSE水平。

2.5 大鼠心臟、腦組織病理觀察

抽血后，將“2.4”項下各組同批次大鼠處死，每只大鼠取相同位置心臟、腦組織各1塊，使用10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋、切片（5 μm），常規蘇木精-伊紅（HE）染色后，于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件分析數據。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存曲線比較采用Log-rank檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 大鼠平均生存時間及24 h生存率檢測結果

S組大鼠的平均生存時間為（1 424.5±10.68）min，24 h生存率為90%；SS組大鼠的平均生存時間為（972.05±128.52）min，24 h生存率為55%；SSV組大鼠的平均生存時間為（1 240.80±84.66）min，24 h生存率為75%。與S組大鼠比較，SS組大鼠24 h生存率顯著降低（P＜0.05）；與SS組大鼠比較，SSV組大鼠24 h生存率顯著升高（P＜0.05）。結果見圖1。

圖1 各組大鼠24 h生存曲線圖

3.2 大鼠生命體征檢測結果

與S組比較，SS組大鼠燙傷后0、2、5 h的MAP、RT、HR和燙傷后0、2 h的RR均顯著降低（P＜0.05）；與SS組比較，SSV組大鼠燙傷后2、5 h的MAP、RT、HR和燙傷后2 h的RR均顯著升高（P＜0.05）。結果見表1（表中，1 mmHg＝133.322 Pa）。

表1 各組大鼠生命體征檢測結果（±s，n＝10）

表1 各組大鼠生命體征檢測結果（±s，n＝10）

a：與S組比較，P＜0.05；b：與SS組比較，P＜0.05

指標MAP/mmHg RT/℃RR/（次/min）HR/（次/min）燙傷前126.2±5.5 127.1±6.9 125.5±7.8 36.8±0.6 36.7±0.7 36.7±0.5 95.7±4.6 94.6±5.9 96.0±5.8 435.2±40.7 431.2±45.0 443.9±34.3組別S組SS組SSV組S組SS組SSV組S組SS組SSV組S組SS組SSV組燙傷后0 h 125.5±6.9 109.1±11.8a 108.7±10.8 36.6±1.4 27.1±1.1a 27.2±1.1 93.1±7.7 81.9±5.1a 82.1±4.6 444.1±30.9 355.1±28.6a 351.2±31.2燙傷后2 h 123.4±6.8 92.4±13.4a 111.2±7.9b 35.2±1.2 28.2±1.8a 29.9±0.9b 87.1±3.4 80.7±10.2a 82.9±12.8b 369.8±24.0 310.6±35.7a 347.7±30.1b燙傷后5 h 126.3±6.9 98.8±14.1a 114.3±13.1b 35.7±1.4 30.5±1.7a 32.2±1.6b 92.4±8.6 92.7±7.5 90.9±5.8 405.8±32.1 334.0±37.6a 381.2±56.4b

3.3 大鼠動脈血氣和臟器功能指標檢測結果

與S組比較，SS組大鼠燙傷后0、2、5 h的動脈血pH、PaO2、HCO3－均顯著降低（P＜0.05），血清CK-MB、NSE水平均顯著升高（P＜0.05），燙傷后2、5 h的動脈血PaCO2顯著升高（P＜0.05）；與SS組比較，SSV組大鼠燙傷后2、5 h的pH、PaO2、HCO3－均顯著升高（P＜0.05），CK-MB、NSE水平和PaCO2均顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠動脈血氣和臟器功能指標檢測結果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠動脈血氣和臟器功能指標檢測結果（±s，n＝10）

a：與S組比較，P＜0.05；b：與SS組比較，P＜0.05

指標pH PaO2/mmHg PaCO2/mmHg HCO3－/（mmol/L）CK-MB/（U/L）NSE/（ng/mL）燙傷后5 h 7.37±0.03 7.26±0.04a 7.35±0.07b 124.9±7.8 112.9±7.1a 121.9±7.3b 38.5±3.7 46.0±3.3a 42.6±3.0b 17.8±2.9 13.6±2.9a 16.9±2.6b 1 045.5±78.3 1 907.8±192.5a 1 540.5±190.4b 9.7±1.7 15.2±2.1a 11.8±2.2b組別S組SS組SSV組S組SS組SSV組S組SS組SSV組S組SS組SSV組S組SS組SSV組S組SS組SSV組燙傷前7.38±0.02 7.39±0.03 7.40±0.04 127.9±7.2 128.1±7.8 128.1±7.4 35.5±3.2 35.3±3.8 35.3±3.6 22.9±2.7 22.2±3.6 22.9±3.4 626.7±51.5 625.2±65.6 625.7±66.4 7.5±1.1 7.6±1.2 7.5±1.1燙傷后0 h 7.31±0.04 7.24±0.07a 7.25±0.07 120.7±7.0 114.7±7.5a 114.1±7.1 37.6±3.5 38.2±2.8 38.3±2.5 17.5±2.0 14.5±2.2a 14.6±1.9 625.1±46.8 751.7±94.5a 757.7±74.6 7.5±1.7 13.2±2.8a 13.2±2.7燙傷后2 h 7.29±0.03 7.18±0.05a 7.27±0.08b 116.9±6.8 101.7±7.3a 108.8±6.5b 39.3±3.8 47.6±3.4a 43.9±3.1b 16.1±1.7 12.1±1.4a 13.8±1.8b 728.3±68.5 1 411.2±163.6a 1 197.2±195.8b 8.3±1.9 17.2±2.3a 13.8±2.1b

3.4 大鼠心臟、腦組織病理觀察結果

HE染色結果顯示，各組大鼠燙傷前心臟、腦組織結構完整清晰，細胞排列緊密，無水腫。在燙傷后2、5 h，大鼠心臟、腦組織間隙增寬，細胞腫脹，排列紊亂，且隨著時間的延長，損傷程度逐漸加重。其中，SS組大鼠心臟、腦組織損傷程度較S組明顯加重；而與SS組比較，SSV組大鼠心臟、腦組織損傷程度明顯減輕。結果見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠心臟組織病理顯微圖（HE染色，×400）

圖3 各組大鼠腦組織病理顯微圖（HE染色，×400）

4 討論

海水具有低溫、高滲透壓、高致病菌等特點，海水浸泡后易造成機體體溫降低、高滲性脫水、血流動力學紊亂、凝血功能障礙、心腦等重要臟器功能受損[10－13]。嚴重燒傷會導致大面積皮膚保護屏障受損，且海水浸泡會加劇創面滲出及組織脫水，增加休克的嚴重程度和組織的缺血缺氧性損害[14]。

丙戊酸鈉是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，在臨床上常用于治療癲癇。既往研究發現，丙戊酸鈉能改善失血性休克和燙傷模型大鼠的心、腦、肺、腸等臟器功能，抑制炎癥反應，降低血管通透性[6－7，15－17]。本研究通過建立35%總體表面積Ⅲ度燙傷合并海水浸泡延遲補液大鼠模型來研究丙戊酸鈉對大鼠心腦損傷的保護作用，結果顯示，大鼠單純燙傷后24 h生存率為90%，燙傷后海水浸泡24 h生存率降低至55%，證實嚴重燙傷合并海水浸泡會提高病死率；而給予丙戊酸鈉治療后，大鼠24 h生存率提高至75%，平均生存時間顯著延長。CK-MB和NSE是反映心臟和腦組織損傷的重要標志物[18－19]，本研究中，SS組和SSV組大鼠燙傷后0、2、5 h的CK-MB、NSE水平均較S組顯著升高；給予丙戊酸鈉治療后，在燙傷后2、5 h，CK-MB、NSE水平均較SS組顯著降低。這提示在嚴重燙傷合并海水浸泡延遲補液的治療過程中，海水浸泡后即刻給予丙戊酸鈉治療，能提高大鼠燙傷后早期生存率，延長其生存時間，保護其心腦功能。

海水浸泡后引起大鼠中心溫度降低、血壓及HR下降、呼吸抑制、循環功能紊亂，合并嚴重燒傷時，損傷程度進一步加重[9，20]。在本研究中，燙傷合并海水浸泡后大鼠RT、RR、MAP、HR均顯著降低，隨燙傷后時間延長及延遲補液，其燙傷后5 h的RT、MAP、HR仍低于S組，證實燙傷合并海水浸泡后機體損傷程度較單純燙傷更加嚴重，生命體征更加不平穩；給予丙戊酸鈉治療后，在燙傷后2、5 h，大鼠RT、MAP、HR均較SS組顯著升高，表明丙戊酸鈉有助于燙傷大鼠血流動力學的穩定，并可維持其基本生命體征平穩，增加其對休克的抵抗能力。

嚴重燒傷易導致低血容量性休克、組織和器官灌注不足、細胞缺血缺氧、酸堿代謝產物失衡[21]。本研究發現，與S組比較，SS組燙傷后0、2、5 h的pH、PaO2、HCO3－顯著降低，燙傷后2、5 h的PaCO2顯著升高，表明海水浸泡會加重燙傷后缺血缺氧性損害，酸性代謝產物增多；給予丙戊酸鈉治療后，SSV組大鼠燙傷后2、5 h的pH、PaO2、HCO3－均較SS組顯著升高，PaCO2顯著降低，表明丙戊酸鈉在嚴重燙傷合并海水浸泡延遲補液模型大鼠中，能改善其細胞缺血缺氧狀態，維持酸堿平衡和內環境穩定。病理結果提示，各組燙傷后2、5 h的心臟和腦組織間隙增寬，細胞腫脹，結構紊亂，隨傷后時間延長，組織損傷越重；在燙傷后2、5 h，SS組損傷程度較S組明顯加重，而SSV組損傷程度較SS組明顯減輕，表面丙戊酸鈉能減輕嚴重燙傷合并海水浸泡延遲補液大鼠心腦損傷，維持其正常結構，保護其心腦功能。

綜上所述，丙戊酸鈉能延長嚴重燙傷合并海水浸泡延時補液模型大鼠的生存時間，提高其生存率，保護其心腦功能，改善其細胞缺血缺氧狀態，提高其機體抗休克能力。但由于燙傷合并海水浸泡機制復雜，具體作用機制有待進一步深入探究。