肺炎克雷伯菌對多黏菌素的耐藥機制研究進展Δ

徐 特，錢 妍，李 頔（重慶醫科大學附屬第二醫院藥學部，重慶 400010）

肺炎克雷伯菌是腸桿菌科克雷伯菌屬中最主要的一種病原菌，廣泛存在于自然環境中，同時其也可定植于人的腸道、口腔以及皮膚等部位。肺炎克雷伯菌作為院內及社區感染的常見致病菌，可導致肺炎、尿路感染、膿毒血癥及肝膿腫等疾病。由于抗生素的大量使用，肺炎克雷伯菌呈現出多藥耐藥（multiple drug resistance，MDR）趨勢，尤其是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenemresistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）的出現，意味著可用于治療肺炎克雷伯菌感染的抗生素越來越少，嚴重威脅著人類健康[1]。

多黏菌素是由多黏芽孢桿菌合成的一類具有抗菌活性的物質，對肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌等有著良好的殺菌作用。由于多黏菌素具有神經及腎臟毒性，所以該藥在臨床上已很少使用。鑒于CRKP嚴峻的耐藥現狀以及可使用的抗生素屈指可數，多黏菌素以其獨特的抗菌機制成為了治療CRKP感染的最后一道防線[2]。但隨著近數十年來多黏菌素使用的增加，國內外肺炎克雷伯菌耐藥株的報道也呈上升趨勢[3]。這不僅大大增加了感染的防控成本，也危害著患者的生命安全。基于此，本文就目前已報道的肺炎克雷伯菌對多黏菌素的耐藥機制作一綜述，以期為多黏菌素的合理使用及耐藥肺炎克雷伯菌的防治提供依據。

1 多黏菌素的抗菌機制

多黏菌素是一類環狀肽抗菌劑，按結構差異可將此類藥物分為A、B、C、D、E類。臨床上最常用的是多黏菌素B和多黏菌素E（也稱黏菌素）。這2種藥物均表現出親水、親脂的兩性分子特點，只是在肽環上的氨基酸不同——多黏菌素B為D-苯丙氨酸，多黏菌素E為D-亮氨酸（具體化學結構見圖1）。多黏菌素B、E對病原菌的作用機制類似，兩者化學結構中所含的二氨基丁酸殘基可與革蘭氏陰性菌外膜脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）部件脂質A上的游離磷酸基團直接結合，從而破壞細菌外膜的穩定性，導致菌體破裂、溶解，繼而發揮殺菌作用[4－6]。除上述作用機制外，目前還有很多關于多黏菌素殺菌機制的假說，包括影響細菌的結構、呼吸作用、核糖體結合和分裂以及誘導活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生等[7]。

圖1 多黏菌素B、E的化學結構式

2 多黏菌素的耐藥機制

由于多黏菌素的主要作用靶點是LPS，因此目前大多數多黏菌素耐藥機制研究主要集中在LPS的結構修飾上[3]。此外，莢膜多糖過表達、外排泵過表達等機制也被證實與耐多黏菌素肺炎克雷伯菌的出現有關[8－9]。基于此，本文對這幾種耐藥機制進行歸納介紹。

2.1 LPS的結構修飾

2.1.1 染色體介導的LPS結構修飾 肺炎克雷伯菌的LPS結構修飾主要是向脂質A添加4-氨基-L-阿拉伯糖（4-amino-4-deoxy-L-arabinose，L-Ara4N）或磷酸乙醇胺（phosphoethanolamine，pEtN），這2種修飾會導致LPS結構和電位發生改變，從而減少多黏菌素與肺炎克雷伯菌的結合[10－11]。

上述2種LPS結構修飾與PmrA/B以及PhoP/Q雙組分信號轉導系統激活密切相關。PmrA/B與PhoP/Q均為跨膜信號轉導元件，其中PhoQ和PmrB為組氨酸激酶，可感應外界刺激，從而活化細胞質內的反應調控因子[12]。PhoQ、PmrA、PmrB基因的錯義突變導致PmrA/B的活化，從而上調PmrCAB和arnBCADTEF（也稱為PmrHFIJKLM）操縱子，進而促進pEtN和L-Ara4N的合成以及向脂質A的轉移。其中，pEtN可升高脂質A的電位，L-Ara4N可直接中和脂質A的電荷[13－15]。另外，PhoP/Q雙組分信號轉導系統的負反饋調節因子MgrB基因的突變也被證實可導致細菌對多黏菌素耐藥，其原因一方面在于MgrB對PhoP/Q雙組分信號轉導系統的抑制作用減弱，導致eptE（pEtN轉移酶）促使pEtN向外膜3-脫氧-D-甘露糖醛酸殘基轉移，另一方面MgrB的插入失活（如可移動元件ISKpn14序列）可活化PmrA調控因子，進而促進L-Ara4N的合成以及向脂質A的轉移[16－17]。PmrD作為一類連接PmrA/B及PhoP/Q的信號蛋白，可以阻斷經PmrB活化后的磷酸化PmrA的固有去磷酸化，從而促進PmrA下游基因的轉錄與表達，最終加強LPS結構修飾，導致耐藥[18]。

CrrA/B是一類新發現的可能與多黏菌素耐藥機制有關的雙組分系統，同樣由感受器和調控因子組成，其所介導的多黏菌素耐藥機制表現為調節CrrB基因臨近的H239-3059基因、H239-3062基因（即CrrC基因，與糖基轉移相關）來影響LPS修飾[19]。Cheng等[11]研究發現，CrrB的氨基酸替換會降低肺炎克雷伯菌對多黏菌素的敏感性，這是因為CrrB基因的突變可誘導H239-3062（即CrrC）表達，而CrrC可通過PmrA/B促進PmrC和PmrHFIJKLM操縱子的表達，進而使細菌對多黏菌素耐藥。

綜上，肺炎克雷伯菌對多黏菌素耐藥的調控通路主要包括PhoP/Q、PmrA/B、CrrA/B這3類雙組分系統，且三者之間存在密切聯系（三者參與LPS結構修飾的機制見圖2）。

圖2 雙組分系統參與LPS修飾的機制

2.1.2 質粒介導的LPS修飾 除上述集中由染色體介導的耐藥調控基因突變外，革蘭氏陰性菌還可通過質粒介導的黏菌素可移動耐藥（mobile colistin resistance，mcr）基因及其變異體在菌群間的水平傳播而獲得耐藥[20]。在Du等[21]第一次發現攜帶mcr-1基因的耐多黏菌素肺炎克雷伯菌后，在中國[22]、意大利[23]、埃及[24]等地已有多篇有關mcr基因及其變異體導致細菌對多黏菌素耐藥的報道，且來源包括了人、動物以及環境樣本等。mcr基因的獨特遺傳結構在很大程度上造成了該基因的全球擴散。

mcr基因多位于質粒（包括IncI2、IncHI2、IncX4、IncN等）上，且基因結構中多包含有移動元件ISApl1。mcr基因具有可傳播性，含有與以上幾類質粒遺傳結構類似的細菌更易于通過質粒結合獲得耐藥性，這也導致了耐藥菌株的快速擴散[25]。除mcr-1外，在肺炎克雷伯菌中也發現了mcr-1的等位基因，如mcr-2、mcr-3、mcr-7、mcr-8、mcr-9等[24，26－28]。以mcr-1為例，其編碼的pEtN轉移酶可催化已合成的pEtN向脂質A磷酸基團轉移，增加脂質A位點的陽離子電荷，從而減少多黏菌素與LPS的結合，進而導致細菌對多黏菌素耐藥[5]。

2.2 莢膜多糖的過表達

Campos等[29]研究發現，當肺炎克雷伯菌暴露于多黏菌素時，莢膜多糖的過表達可對肺炎克雷伯菌起保護作用。莢膜多糖存在于細菌的最外層，作為物理屏障其可減輕菌體受到的外界傷害。莢膜多糖可通過與多黏菌素結合來減少多黏菌素與LPS的作用。另外，該學者團隊還發現，部分肺炎克雷伯菌缺乏含O抗原的LPS，其莢膜多糖是唯一可阻礙多黏菌素作用的屏障。相關研究也發現，肺炎克雷伯菌可從菌體表面釋放帶負電荷的莢膜多糖，這類莢膜多糖可捕獲多黏菌素，使多黏菌素與非活性位點的作用增加，進而減少多黏菌素與細胞外膜的接觸，從而影響其正常殺菌作用[30]。Fresno等[8]提出，莢膜多糖是以離子相互作用的形式穩定結合于LPS，當環境中存在多黏菌素時，該離子相互作用會被多黏菌素所帶的電荷擾亂，故莢膜多糖可脫離LPS與多黏菌素結合，進而減輕多黏菌素對肺炎克雷伯菌外膜的破壞。另一項關于抗菌肽對肺炎克雷伯菌外膜作用的研究發現，外膜蛋白OmpA缺失的菌株，其莢膜多糖表達下降，進而導致肺炎克雷伯菌對多黏菌素B的敏感性增加[31]。由此可知，可通過抑制OmpA來緩解耐藥，這為克服細菌耐藥性提供了新思路。

2.3 外排泵的過表達

細菌多藥外排泵被認為與耐藥密切相關。Srinivasan等[32]研究發現，KpnEF外排泵可介導肺炎克雷伯菌對多黏菌素耐藥，該外排泵屬于小多藥外排家族（small MDR family，SMR），另外KpnEF跨膜轉運蛋白失活還可導致莢膜多糖的合成障礙。全基因組測序發現，存在KpnEF基因點突變且同時合并PmrA、CrrB基因突變的肺炎克雷伯菌可對多黏菌素表現出耐藥[33]。Padilla等[34]研究發現，當編碼acrAB多藥外排泵的基因被敲除后，肺炎克雷伯菌對多黏菌素的敏感性相較于野生型菌株發生改變。該外排泵由acrRAB操縱子編碼，其中acrA編碼錨定于細胞內膜上連接內膜與外膜的間質蛋白，acrB編碼錨定于細胞質膜的整合蛋白，acrR編碼外排泵的抑制因子。相較于野生型菌株，acrB基因敲除菌株對多黏菌素更為敏感，而acrR敲除的菌株則相反，這說明acrR對藥物外排表現為抑制效應。另有研究發現，CrrB基因的點突變可導致屬于耐藥結節分化（resistance nodulation division，RND）家族的新型外排泵H239-3064的表達減少，當該外排泵過表達時，肺炎克雷伯菌對多黏菌素的敏感性大大降低[35]。相關研究發現，多藥外排泵KeXD與H239-3064有著100%的氨基酸一致性，提示KeXD也可因CrrB的突變而出現過表達，從而導致細菌對多黏菌素耐藥[36]。RamA和SoxS是AcrBTolC外排泵的調節因子，相較于多黏菌素敏感株，兩者在耐藥株中的表達更高，其中RamA同時影響著脂質A的合成，在其負調節因子RamR失活的情況下，脂質A的合成增加，因而使細菌表現出對多黏菌素不敏感[37－38]。

3 異質性耐藥

由單一分離菌株培養所得的細菌群體中，可能存在不同亞群耐藥情況不同的現象，如部分敏感、部分耐藥，此種情況為異質性耐藥，即有著相同或相似基因型的菌株卻表現出不同的耐藥表型。一旦暴露于抗生素中，異質性耐藥菌株即可被篩選出來[39]。目前，臨床常以最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）來判斷細菌是否耐藥，但在某些敏感菌株中，僅以MIC判斷則難以排除異質性耐藥。雖然，導致異質性耐藥發生的機制尚不明確，但已有報道證明，亞群耐藥性的出現與增強主要是由包括典型抗性基因在內的基因自發性擴增所致[40]。多黏菌素異質性耐藥的出現，很有可能部分與多黏菌素耐藥調控相關基因發生不穩定突變有關。Jayol等[41]和Halaby等[42]的研究均發現，多黏菌素異質性耐藥的肺炎克雷伯菌的PhoQ基因存在突變，且后者還發現mgrB、yciM基因（編碼LPS調節蛋白）和lpxM基因亦存在突變，這提示除LPS結構修飾外，多黏菌素耐藥可能還存在其他機制[43]。Cheong等[44]在一株分離自住院患者的肺炎克雷伯菌中發現了mutS的無義突變，該突變直接導致肺炎克雷伯菌對阿米卡星的耐藥以及對多黏菌素的異質性耐藥，且該基因編碼一種廣泛存在于肺炎克雷伯菌中的DNA修復酶，這意味此耐藥突變很有可能影響肺炎克雷伯菌在臨床上的防治過程。

4 結語

多黏菌素作為目前用于治療多藥耐藥革蘭氏陰性菌感染的“最后防線”，由于其使用增加以及耐藥基因的水平傳播等，導致肺炎克雷伯菌對其耐藥增加。綜上所述，肺炎克雷伯菌耐多黏菌素的機制包括細菌外膜LPS的結構修飾（主要為L-Ara4N和pEtN向脂質A轉移）、莢膜多糖的過表達、多藥外排泵的過表達等。就LPS結構修飾而言，染色體介導的LPS結構修飾直接導致了細菌的獲得性耐藥，質粒介導的LPS結構修飾則引發了耐藥性的水平傳播。雖然肺炎克雷伯菌耐藥機制可分為上述幾種，但在不同的肺炎克雷伯菌菌株中，可能存在多種耐藥機制共存的現象，而且肺炎克雷伯菌作為院內感染的主要病原菌，常與其他致病菌共同檢出，這也有可能導致產生某些本不屬于肺炎克雷伯菌的耐藥機制。現有研究可能還無法解釋某些臨床中存在的問題，如異質性耐藥的具體機制等，但相信未來的科學研究將進一步明確肺炎克雷伯菌的耐藥機制，為耐藥菌的檢測以及感染的防控提供證據支撐。雖然目前對已發生的多黏菌素耐藥尚無較好的阻斷實踐，但為避免多黏菌素耐藥現狀的進一步惡化，應合理優化臨床用藥，加強監督管理，盡可能減少耐藥基因的擴散。