抗婦炎膠囊的指紋圖譜建立、化學模式識別分析及含量測定Δ

王銘菊，黃家宇，杜秋瑩，張會，嚴學輝，王福勇，李莉#（.貴州醫科大學藥學院，貴陽 55005；.貴州遠程制藥有限責任公司，貴陽 55008）

抗婦炎膠囊是源于苗族驗方的貴州名優苗族藥制劑，含苦參、杠板歸、黃柏、連翹、益母草、當歸、烏藥、赤小豆、艾葉等多味藥，用于治療濕熱下注型盆腔炎、陰道炎、慢性宮頸炎、赤白帶下、陰癢、出血、痛經等婦科炎癥類疾病，療效顯著[1]。方中君藥苦參清熱燥濕、殺蟲利尿，其所含苦參堿具有廣譜的殺菌作用；君藥杠板歸清熱解毒，其所含蘆丁具有消炎抑菌、抗氧化等藥理作用[2－3]；二者合用，有清熱燥濕、解毒止帶之功，針對下腹疼痛、帶下、陰癢主證病機而設。臣藥黃柏和連翹清熱，益母草活血調經，黃柏中黃柏堿、小檗堿具有瀉火解毒、退熱除蒸的功效[2，4]，連翹中連翹酯苷A具有解熱、抗感染等藥理活性[5]；三者合用，具有增強君藥清熱解毒、燥濕止帶之功，并能祛瘀止痛、利水消腫。佐使藥當歸活血補血，烏藥行氣止痛，赤小豆利水消腫、解毒排膿，艾葉散寒止痛、溫中調經；四者合用，具有增強行氣祛瘀止痛、利水消腫之功。當歸、艾葉、烏藥三者藥性偏溫，可佐制方中君臣藥，以防凝滯氣血。諸藥寒溫并用，并行不悖，諸癥悉解。

抗婦炎膠囊為獨家專利苗藥制劑，已被納入2004年版《國家基本藥物目錄》，但現有質量標準僅有薄層色譜鑒別和苦參中苦參堿的定量測定，無法全面評價該制劑的整體質量[6－7]。中藥指紋圖譜具有評價中藥優劣，確保其質量穩定、一致等優點，可作為評價中藥整體質量的技術手段。化學模式識別中主成分分析能對數據進行快速及可視化識別；聚類分析能確定樣品批次間的穩定性，與指紋圖譜結合，有利于揭示中成藥復雜成分的內在規律[8－9]。鑒于此，本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）法建立抗婦炎膠囊的指紋圖譜，同時進行化學模式識別分析，并測定其中苦參、杠板歸、連翹、黃柏飲片中苦參堿、蘆丁、連翹酯苷A、鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿5種活性成分的含量，以期完善抗婦炎膠囊的質量控制方法，促進其質量標準的提升。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Ultimate 3000型HPLC儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、MS105DU型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、KQ-250DA型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

抗婦炎膠囊（批號分別為20200503、20200603、20210108、20210302、20191208、20191109、20191023、20200101、20200202、20200118、20200621，編號依次為S1～S11，規格均為每粒裝0.35 g）以及苦參、杠板歸、黃柏、連翹、益母草、赤小豆、艾葉、當歸、烏藥飲片均由貴州遠程制藥有限責任公司提供，上述飲片經貴州醫科大學藥學院龍慶德副教授鑒定均為真品；鹽酸黃柏堿、連翹酯苷A、苦參堿、鹽酸小檗堿、蘆丁對照品（批號分別為wkq21031209、wkq21040902、wkq21030302、wkq2102-2004、wkq20030203，純度均不低于98%）均購自四川維克奇生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品、單味飲片及缺味陰性樣品溶液 取抗婦炎膠囊內容物0.5 g，精密稱定，轉移至100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，稱定質量；超聲（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出放冷至室溫，再次稱定質量，用70%甲醇補足減少的質量，搖勻，靜置；用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即為供試品溶液，于4℃下保存，備用。按處方比例同法制備各單味飲片及分別缺苦參、杠板歸、黃柏、連翹的缺味陰性樣品浸膏或粉末，并按照上述供試品溶液的制備方法制備單味飲片溶液以及分別缺苦參、杠板歸、黃柏、連翹的缺味陰性樣品溶液。

2.1.2 混合對照品溶液 精密稱取苦參堿、鹽酸黃柏堿、蘆丁、連翹酯苷A、鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇溶解、稀釋，制成各成分質量濃度分別為3 809.4、84.5、166.6、420.0、596.2 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2 指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 采用ACE C18-AR（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～4 min，5%B；4～21 min，5%B→10%B；21～35 min，10%B→11%B；35～45 min，11%B→15%B；45～65 min，15%B→20%B；65～85 min，20%B→35%B；85～95 min，35%B→70%B）；流速為1 mL/min；檢測波長為220 nm（0～80 min）、254 nm（81～95 min）；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.2.2 精密度試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液（S6），按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖。將峰22（連翹酯苷A）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.61%，相對峰面積的RSD均小于2.97%（n＝6），表明本方法的精密度良好。

2.2.3 穩定性試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液（S6），分別在室溫放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將峰22（連翹酯苷A）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.77%，相對峰面積的RSD均小于3.41%（n＝6），表明該供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.2.4 重復性試驗 取抗婦炎膠囊（S6）內容物適量，共6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將峰22（連翹酯苷A）作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.46%，相對峰面積的RSD均小于2.89%（n＝6），表明本方法的重復性良好。

2.2.5 指紋圖譜的生成和共有峰的指認 取11批抗婦炎膠囊供試品溶液及混合對照品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，將11批樣品的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》中進行分析。將樣品S1的圖譜設為參照圖譜，設置時間窗寬度為0.2 min，經多點校正后進行全譜峰匹配生成11批樣品色譜圖的疊加指紋圖譜，并采用中位數法生成對照指紋圖譜R。通過對比供試品溶液（S1）與混合對照品溶液的色譜圖進行色譜峰的指認。結果顯示，共標定出29個共有峰，并指認出了其中5個共有峰[苦參堿（峰3）、鹽酸黃柏堿（峰14）、蘆丁（峰20）、連翹酯苷A（峰22）、鹽酸小檗堿（峰28）]。結果見圖1、圖2。

圖1 11批抗婦炎膠囊的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜R

圖2 供試品溶液和混合對照品溶液的HPLC圖

2.2.6 相似度評價 以對照指紋圖譜R為參照，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》進行11批抗婦炎膠囊的相似度評價。結果顯示，11批樣品與對照指紋圖譜R的相似度分別為0.997、0.998、0.998、0.999、0.997、0.997、0.997、1.000、0.999、0.999、0.999，均大于0.99，表明抗婦炎膠囊的制備工藝較穩定。

2.2.7 共有峰的藥材歸屬 取“2.1.1”項下單味飲片溶液和供試品溶液（S1），按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖及共有峰的保留時間。對比供試品溶液與各單味飲片溶液的色譜圖進行共有峰的歸屬。結果顯示，峰3～5、29歸屬于苦參，峰2、4、20歸屬于杠板歸，峰7、8、11、14～16、28歸屬于黃柏，峰22、23、27歸屬于連翹，峰12歸屬于益母草，峰9歸屬于當歸，峰13歸屬于烏藥。結果見圖3。

圖3 單味飲片溶液與供試品溶液的HPLC圖

2.3 化學模式識別分析

2.3.1 聚類分析 采用SPSS 26.0軟件對11批抗婦炎膠囊29個共有峰的峰面積進行聚類分析。結果顯示，當平方歐氏距離為5時，11批樣品可被聚為2類：S1～S9聚為第一類，S10、S11聚為另一類。結果見圖4。

圖4 11批抗婦炎膠囊的聚類分析樹狀圖

2.3.2 主成分分析 采用SIMCA 14.1軟件對11批抗婦炎膠囊29個共有峰的峰面積進行主成分分析，以主成分的初始特征值＞1為抗婦炎膠囊質量評價的判斷依據[10]。結果顯示，前4個主成分的初始特征值＞1，累計方差貢獻率分別為59.920%、79.379%、87.270%、93.259%，說明這4個主成分能夠涵蓋29個共有成分93.259%的信息。主成分1的初始特征值最大（17.377），涵蓋的信息最豐富，對應成分峰為峰3、5～8、11～16、18～29；主成分2的初始特征值為5.643，對應成分峰為峰1、2、4、9；主成分3的初始特征值為2.288，對應成分峰為峰10；主成分4的初始特征值為1.737，對應成分峰為峰17。主成分1中得分系數較大的有峰3（苦參堿，0.991）、6（0.913）、8（0.906）、14（鹽酸黃柏堿，0.931）、15（0.973）、18（0.946）、22（連翹酯苷A，0.957）、25（0.945）、26（0.977）、27（0.910）、28（鹽酸小檗堿，0.963）。主成分分析結果（圖5）顯示，11批樣品被分為2類：S1～S9分為第1類，S10、S11分為第2類。該結果與聚類分析結果一致。

圖5 11批抗婦炎膠囊的主成分分析得分圖

2.4 含量測定

2.4.1 系統適用性試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液、缺味陰性樣品溶液及“2.1.2”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，苦參堿、鹽酸黃柏堿、蘆丁、連翹酯苷A、鹽酸小檗堿色譜峰與相鄰色譜峰間的分離度均大于1.5，理論板數均大于9 000，且缺味陰性樣品溶液對測定無干擾，表明本方法的系統適用性較好。結果見圖6。

圖6 抗婦炎膠囊系統適用性試驗的HPLC圖

2.4.2 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液1、2、4、6、8 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，得系列質量濃度的線性工作液。取上述線性工作液與“2.1.2”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各成分峰面積為縱坐標（Y）、質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸分析。結果顯示，苦參堿等5種成分在各自的質量濃度范圍內線性關系均良好。結果見表1。

表1 苦參堿等5種成分的線性關系考察結果

2.4.3 精密度試驗 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，苦參堿、鹽酸黃柏堿、蘆丁、連翹酯苷A、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為2.72%、2.47%、2.76%、2.66%、2.98%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取“2.1.1”項下供試品溶液（S6），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，苦參堿、鹽酸黃柏堿、蘆丁、連翹酯苷A、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.64%、0.80%、1.01%、0.95%、0.66%（n＝6），表明該供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.4.5 重復性試驗 取同一批抗婦炎膠囊（S6）內容物適量，共6份，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定，記錄峰面積，并代入回歸方程計算5種成分的含量。結果顯示，苦參堿、鹽酸黃柏堿、蘆丁、連翹酯苷A、鹽酸小檗堿含量的RSD分別為1.71%、1.51%、1.52%、1.46%、1.60%（n＝6），表明本方法的重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（S6）0.25 g，共6份，分別加入各單一對照品溶液1 mL（苦參堿、鹽酸黃柏堿、蘆丁、連翹酯苷A、鹽酸小檗堿的質量濃度分別為13.223 0、0.265 0、0.854 0、1.359 0、2.145 0 mg/mL，溶劑為甲醇），按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果顯示，苦參堿、鹽酸黃柏堿、蘆丁、連翹酯苷A、鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為109.75%、110.05%、99.62%、93.86%、102.27%，RSD均小于3.00%（n＝6），表明本方法的準確度良好。結果見表2。

表2 苦參堿等5種成分的加樣回收率試驗結果（n＝6）

2.4.7 樣品含量測定 取11批抗婦炎膠囊內容物適量，分別按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并代入回歸方程計算5種成分的含量。每份樣品測定3次，取平均值。結果顯示，11批抗婦炎膠囊中苦參堿、鹽酸黃柏堿、蘆丁、連翹酯苷A、鹽酸小檗堿的含量分別為29.320 5～60.144 3、0.621 6～1.076 6、1.025 9～2.830 5、2.899 3～6.212 7、4.425 1～8.581 6 mg/g。結果見表3。

表3 抗婦炎膠囊中苦參堿等成分的含量測定結果（n＝3，mg/g）

3 討論

筆者前期考察了不同提取方式（回流、超聲）、不同體積分數的甲醇（30%、50%、70%、100%）以及不同提取時間（0.5、0.75、1、1.5、2 h）對抗婦炎膠囊提取效果的影響，最終確定以70%甲醇超聲0.5 h為該制劑的最佳提取條件。同時，筆者前期還考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液等流動相對樣品的洗脫能力及色譜峰的分離效果，最終選擇以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，此時樣品的洗脫效果及色譜峰的分離效果最好。此外，筆者前期對該樣品進行了全波長掃描，通過觀察3D圖譜中各色譜峰的數量、峰形及響應程度，最終確定了最佳的洗脫程序（洗脫程序見“2.2.1”項）和檢測波長（0～80 min的檢測波長為220 nm，81～95 min的檢測波長為254 nm）。

本研究采用HPLC法建立了抗婦炎膠囊的指紋圖譜，共標示出29個共有峰（色譜峰峰面積占比＞90%），并指認出了包含苦參堿等在內的5個化學成分；11批抗婦炎膠囊的指紋圖譜與對照指紋圖譜R的相似度均大于0.99，表明該制劑制備工藝較穩定。聚類分析結果顯示，當平方歐氏距離為5時，11批樣品可聚為2類：S1～S9聚為第1類，S10、S11聚為第2類。主成分分析結果顯示，可能影響抗婦炎膠囊質量的成分有峰3（苦參堿）、6、8、14（鹽酸黃柏堿）、15、18、22（連翹酯苷A）、25、26、27、28（鹽酸小檗堿）。此外，主成分分析發現，樣品S10、S11與其他批次存在差異，這可能是藥材批次間的差異及制劑生產過程中的操作誤差等原因導致的。上述結果提示，不僅在生產過程中要把控抗婦炎膠囊的質量，還應重視原藥材的質量控制，如規范藥材的產地來源、采收季節以及藥材飲片的質量控制標準，確保抗婦炎膠囊質量的穩定性。

有研究表明，苦參堿為苦參的指標性成分，在婦科治療領域中主要用于治療宮頸炎、陰道炎[11]；鹽酸黃柏堿及鹽酸小檗堿為黃柏的指標性成分，用于治療慢性盆腔炎、皮膚炎癥等疾病[12]；蘆丁為杠板歸的活性成分，具有抗炎、抗菌及免疫調節的作用，可用于治療慢性宮頸炎、子宮內膜炎等婦科疾病[13]；連翹酯苷A為連翹的特征成分，可用于治療濕熱型疾病，并可發揮抗菌、抗炎作用[14]。基于上述成分的藥理活性與抗婦炎膠囊的功能主治一致，因此本研究對上述5種成分進行了含量測定研究。含量測定結果顯示，不同批次樣品中目標成分的含量存在一定差異，而具有與抗婦炎膠囊功能主治一致的成分的含量均一、穩定是評判該藥品能否達到治療效果的重要因素。因此，可考慮將本研究中的苦參堿等5種有效成分作為抗婦炎膠囊的定量控制指標，以完善該制劑的質量標準。

綜上，本研究采用HPLC法建立了穩定、可靠的抗婦炎膠囊的指紋圖譜和含量測定方法，再結合化學模式識別分析，可為抗婦炎膠囊質量標準的提升提供參考依據。