基于熵權TOPSIS法綜合評價草果質量Δ

郝佳旭，李元增，范曉，查麗春，馬云淑，2，3，4#（.云南中醫藥大學中藥學院，昆明 650500；2.云南省高校外用給藥系統與制劑技術研究重點實驗室，昆明 650500；3.云南省傣醫藥與彝醫藥重點實驗室，昆明 650500；4.云南省南藥可持續利用重點實驗室，昆明 650500）

草果為姜科植物草果Amomum tsao-koCrevost et Lemaire的干燥成熟果實，主要分布于我國西南地區，其中云南為我國草果的主要產區[1]。草果具有燥濕溫中、截瘧除痰的功效，臨床常用于輔助治療癲癇、慢性腎功能衰竭和慢性再生障礙性貧血等疾病[2]。草果主要含有揮發油類、多酚類、黃酮類等多種化學成分[3－4]，同時具有抗炎鎮痛、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[2，5]。土壤、降雨、光照等對草果質量有著較大的影響，不同產地、采收期的草果質量可能存在差異，而目前對草果質量的評價往往是單因素的，如定量分析草果中黃酮類成分[6]、酚酸類成分[7]、揮發油類成分[8]含量等。這些方法存在一定的局限性，難以對草果整體質量進行評價。因此，有必要建立一種多因素綜合評價草果質量的方法。

熵權TOPSIS法也稱熵權-逼近理想解排序法，主要用于多指標綜合評價。其在計算過程中先以熵權法客觀確定各指標所占權重，將多個指標轉化為單一指標后，依據各樣品與理想解及負理想解的綜合距離進行評價，目前已被廣泛用于多種中藥材的質量評價[9－10]。本課題組前期建立了不同產地、采收期的草果揮發油氣相色譜-串聯質譜（GC-MS）指紋圖譜，發現α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、反式橙花叔醇為草果揮發油中含量相對較高的成分，但未能綜合評價草果的質量[11]。此外，草果多酚中的代表性成分原兒茶酸、香草酸具有較強的抗氧化、抗炎等多種藥理作用，是草果質量評價的重要指標[12]。故本研究采用氣相色譜（GC）法測定草果揮發油中α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、反式橙花叔醇的含量，采用超高效液相色譜（UPLC）法測定草果中原兒茶酸、香草酸的含量，并結合總揮發油、總黃酮、總多酚的含量，使用熵權TOPSIS法建立綜合評價模型來評價不同產地、采收期的草果質量，以期為草果質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Agilent 1290 Series型UPLC儀、Aglient 7820A型GC儀（美國Agilent公司），UV-1800型紫外分光光度計[翱藝儀器（上海）有限公司]，DHAUS@型分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

草果藥材均購自昆明市官渡區德陽遠知藥材經營部（具體樣品信息見表1），經云南中醫藥大學中藥學院張潔副教授鑒定為姜科植物草果A.tsao-koCrevost et Lemaire的干燥成熟果實。其他藥品與試劑有原兒茶酸、香草酸、α-蒎烯、β-蒎烯、α-松油醇、1，8-桉葉素、香葉醇、沒食子酸、蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為 110809-201906、110776-201503、110897-201803、111827-201202、111859-201804、110788-202108、111643-200602、110831-201906、100080-202012，純度均大于91.5%），反式橙花叔醇對照品（上海源葉生物技術有限公司，批號M27N11LB0158，純度大于98%），無水乙醇、甲醇、無水碳酸鈉（天津市致遠化學試劑有限公司，批號分別為20211001321、20210901308、20210901312），硝酸鋁、氫氧化鈉（西隴科學股份有限公司，批號分別為211012、211001），福林酚（上海麥克林生化科技有限公司，批號C12886448）等。

表1 草果藥材的樣品信息

2 方法與結果

2.1 草果總揮發油的含量測定

稱取草果粉末（過三號篩）120 g，加入12倍量（mL/g）水，浸泡3 h；以水蒸氣蒸餾法提取4 h，靜置1 h，加入適量無水硫酸鈉，以6 000 r/min離心10 min，即得淡黃色草果總揮發油。按2020版《中國藥典》（四部）中揮發油測定甲法測定總揮發油含量[13]。每批樣品平行操作2次，取平均值。結果見表2。

2.2 草果總黃酮、總多酚的含量測定

2.2.1 草果總黃酮、總多酚的提取及待測樣品的制備 參照文獻[14]方法提取草果中的總黃酮、總多酚。稱取草果粉末（過三號篩）10 g，加入10倍量（mL/g）70%乙醇，于50℃下超聲（功率100 W，頻率37 kHz）45 min，再于80℃水浴回流提取3次（每次1 h），過濾，取濾液。合并3次濾液，加入70%乙醇稀釋至1 000 mL，以6 000 r/min離心10 min，取上清液即得待測樣品。

2.2.2 草果總黃酮、總多酚的含量測定 參照文獻[4]方法，以蘆丁為參照，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定草果中的總黃酮含量。精密稱取蘆丁對照品5.22 mg，加入70%乙醇定容至25 mL，即得蘆丁對照品溶液。分別吸取蘆丁對照品溶液0.6、1.2、1.5、1.8、2.4、3.0 mL，加入70%乙醇至3 mL，再加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min；依次加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL、甲醇1.2 mL，搖勻，放置15 min，采用紫外分光光度計于510 nm波長處測定吸光度，并以蘆丁質量濃度為橫坐標（x）、吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線。結果顯示，蘆丁的線性方程為y＝10.428 7x+0.023 4（r＝0.999 7），其在 13.92～69.60 μg/mL范圍內線性關系良好。取“2.2.1”項下待測樣品，按蘆丁對照品溶液的操作同法測定吸光度，再代入上述線性方程中計算，即得草果中總黃酮的含量。每批樣品平行操作2次，取平均值。結果見表2。

參照文獻[4]方法，以沒食子酸為參照，采用福林酚法測定草果中的總多酚含量。精密稱取沒食子酸對照品4.08 mg，加入70%乙醇定容至25 mL，即得沒食子酸對照品溶液。分別吸取沒食子酸對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7 mL，依次加入水5 mL、福林酚溶液0.5 mL，搖勻，靜置5 min；加入10%碳酸鈉溶液1.5 mL，搖勻，避光放置1.5 h，采用紫外分光光度計于760 nm波長處測定其吸光度。以沒食子酸質量濃度為橫坐標（x）、吸光度為縱坐標（y）繪制標準曲線。結果顯示，沒食子酸的線性方程為y＝86.276 4x+0.076 0（r＝0.999 2），其在2.29～14.84 μg/mL范圍內線性關系良好。取“2.2.1”項下待測樣品，按沒食子酸對照品溶液的操作同法測定吸光度，再代入上述線性方程中計算，即得草果中總多酚的含量。每批樣品平行操作2次，取平均值。結果見表2。

表2 草果中總揮發油、總黃酮、總多酚和揮發油中6種成分及原兒茶酸、香草酸的含量測定結果（n＝2）

2.3 草果揮發油中6種成分的含量測定

2.3.1 GC條件 毛細管柱為Agilent HP-5（30 m×320 μm，0.25 μm），檢測器為火焰離子化檢測器，進樣口溫度為230℃，檢測器溫度為250℃；柱溫以80℃為起始溫度，保持4 min，再以4℃/min的速率升溫至110℃，保持2 min，最后以4℃/min的速率升溫至180℃；流速為1.5 mL/min，分流比為40∶1，進樣量為1 μL。

2.3.2 供試品溶液的配制 按“2.1”項下方法提取草果揮發油。取草果揮發油100 μL，加入無水乙醇至5 mL，搖勻，以0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.3 混合對照品溶液的配制 精密稱取α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、反式橙花叔醇對照品適量，加入適量無水乙醇，搖勻，即得上述成分質量濃度分別為0.480、0.470、9.540、0.570、1.310、0.590 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3.4 專屬性考察 取無水乙醇、混合對照品溶液及供試品溶液（S1號樣品），按“2.3.1”項下GC條件進樣檢測。結果顯示，無水乙醇對測定無干擾（圖略），各色譜峰峰形良好，分離度均大于1.5。結果見圖1。

圖1 草果揮發油中6種成分的GC圖

2.3.5 線性關系考察 取“2.3.3”項下混合對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于不同10 mL容量瓶中，加入無水乙醇，定容，搖勻，制成系列質量濃度的線性工作溶液，按“2.3.1”項下GC條件進樣檢測，以各成分質量濃度為橫坐標（x）、色譜峰峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線，具體結果見表3。

表3 草果揮發油中6種成分的回歸方程及線性范圍

2.3.6 精密度考察 取“2.3.3”項下混合對照品溶液，按“2.3.1”項下GC條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、反式橙花叔醇峰面積的RSD分別為2.92%、2.27%、2.59%、2.69%、2.89%、2.97%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復性考察 取S1號樣品，按“2.3.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3.1”項下GC條件進樣檢測，記錄峰面積并采用外標法計算各成分含量。結果顯示，α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、反式橙花叔醇含量的RSD分別為1.43%、1.73%、2.23%、1.60%、2.05%、2.27%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.8 穩定性考察 取S1號樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.3.1”項下GC條件進樣檢測，記錄峰面積。結果顯示，α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、反式橙花叔醇峰面積的RSD分別為2.76%、2.26%、2.72%、2.70%、1.42%、2.89%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定。

2.3.9 加樣回收率考察 取已知含量的S1號樣品10 g，共6份，精密稱定，按各成分已知含量的100%加入相應對照品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下GC條件進樣檢測，計算加樣回收率及RSD。結果顯示，α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、反式橙花叔醇的平均加樣回收率分別為99.22%、101.26%、102.42%、100.05%、99.01%、102.01%，RSD分別為1.58%、1.48%、1.88%、0.56%、0.38%、1.10%（n＝6）。

2.3.10 樣品含量測定 取S1～S16號樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下GC條件進樣檢測，記錄峰面積，再按外標法計算草果中α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、反式橙花叔醇的含量。每批樣品平行操作2次，取平均值。結果見表2。

2.4 草果中原兒茶酸、香草酸的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Poroshell 120 SB-C18（250 mm×4.6 mm，4 μm），柱溫為30℃，檢測波長為270 nm，進樣量為6 μL，流動相為0.15%甲酸溶液（A）-乙腈（B）（梯度洗脫：0～5 min，10%B；5～8 min，10%B→20%B；8～12 min，20%B →35%B）。

2.4.2 混合對照品溶液的制備 取原兒茶酸、香草酸對照品適量，置于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，即得上述2種成分質量濃度分別為11.90、23.28 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取草果粉末（過三號篩）10 g，加入甲醇50 mL，于64℃水浴回流提取1 h，放冷后加入甲醇補足減失的質量，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，即得。

2.4.4 專屬性考察 取甲醇（空白對照）和“2.4.2”項下混合對照品溶液和“2.4.3”項下供試品溶液適量，按“2.4.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。結果顯示，甲醇對測定無干擾（圖略），原兒茶酸、香草酸的色譜峰峰形良好，分離度均大于1.5，結果見圖2。

圖2 草果中原兒茶酸、香草酸的UPLC圖譜

2.4.5 線性關系考察 取“2.4.2”項下混合對照品溶液0.42、0.83、1.76、2.50、3.33、10.00 mL，分別置于不同10 mL容量瓶中，加入甲醇，定容，搖勻，制成系列質量濃度的線性工作溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣檢測，以各成分質量濃度為橫坐標（x）、色譜峰峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線。結果顯示，原兒茶酸在0.50～11.90 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為y＝12.241 7x+1.997 6（r＝0.999 5）；香草酸在0.98～23.38 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為y＝15.845 2x+7.474 3（r＝0.999 6）。

2.4.6 精密度考察 取“2.4.2”項下混合對照品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，原兒茶酸、香草酸峰面積的RSD分別為1.28%、1.17%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.7 重復性考察 取S16號樣品，按“2.4.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積并采用外標法計算含量。結果顯示，原兒茶酸、香草酸含量的RSD分別為1.49%、2.29%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.4.8 穩定性考察 取S16號樣品，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時按“2.4.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積。結果顯示，原兒茶酸、香草酸峰面積的RSD分別為1.49%、2.29%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定。

2.4.9 加樣回收率考察 取已知含量的S16號樣品0.5 g，共6份，精密稱定，分別按各成分已知含量的100%加入相應對照品，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣檢測，計算加樣回收率及RSD。結果顯示，原兒茶酸、香草酸的平均加樣回收率分別為102.66%、102.91%，RSD分別為1.42%、1.32%（n＝6）。

2.4.10 樣品含量測定 取S1～S16號樣品，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，再按外標法計算草果中原兒茶酸、香草酸的含量。每批樣品平行操作2次，取平均值。結果見表2。

2.5 基于熵權TOPSIS法評價草果的質量

2.5.1 建立草果的原始數據矩陣 以表2中草果總揮發油、總黃酮、總多酚、揮發油中6種成分及原兒茶酸、香草酸的含量測定結果為指標，建立原始數據矩陣Y＝（Aij）m×n。式中，Aij為第j個指標下第i個項目的評價值，m為樣品批次（m＝16），n為評價指標（n＝11）。

2.5.2 草果各指標原始數據標準化處理 由于各指標單位不統一，故在數據處理前需進行無量綱化處理，將原始數據矩陣Y＝（Aij）m×n轉化為標準化數據矩陣B＝（Xij）m×n。本研究中，評價草果質量的11項指標均為正向指標，標準化公式為Xij＝（Aij－Aminij）/Amaxij－Aminij）。式中，Xij為標準化數據。

2.5.3 草果各指標標準化數據矩陣歸一化處理 將草果中各指標標準化數據矩陣B＝（Xij）m×n轉化為標準化數據概率矩陣P＝（Pij）m×n，轉化公式為。式中，Pij表示第j個指標下第i個項目的概率，且0≤Pij≤1。

2.5.4 草果中各指標信息熵的計算 依據草果中各項指標歸一化結果計算各指標的信息熵（Hj），計算公式為；當Pij＝0 時，lnPij無意義，故當Pij＝0時，將Pij×lnPij修正為0。具體計算結果見表4。

2.5.5 草果中各指標差異系數及熵權系數的計算 熵權法是依據各指標的信息熵大小，得到各指標的離散程度，從而客觀獲得各指標權重，有效避免賦權時主觀性的一種方法。信息熵代表了系統的無序程度，系統越無序，指標信息熵越小，其離散程度越大，可提供的有效信息量就越大，該指標在綜合評價中所占權重就越高[9]。依照草果中各指標的信息熵計算差異系數及熵權系數，差異系數（gj）計算公式為gj＝1－Hj；熵權系數（Wj）的計算公式為，且 0≤Wj≤1。具體計算結果見表4。

表4 草果中11個指標的信息熵、差異系數、熵權系數計算結果

2.5.6 草果中各項指標的加權矩陣建立 將草果各指標的標準化數據矩陣B＝（Xij）m×n中的每一項乘以對應的熵權系數，即得草果各項指標的加權矩陣Z＝（Wj×Xi）jm×n。

2.5.7 草果各項指標的正離差方及負離差方計算 參照草果各項指標的加權矩陣計算正離差方（）2及負離差方，正離差方計算公式為；負離差方計算公式為。

2.5.8 草果樣品與最優方案及最劣方案的歐氏距離及相對貼近度 16批草果樣品與最優方案的歐氏距離（）計算公式為，與最劣方案的歐氏距離計算公式為，16批草果的相對貼近度（Ci）計算公式為。具體計算結果見表5。

表5 草果綜合質量評價結果

2.5.9 草果質量評價結果 依據計算出的相對貼近度大小進行排序，可知16批草果樣品中質量排名前3位的分別是云南保山7月、云南紅河10月和云南文山9月產草果；質量排名后3位的分別是云南德宏9月、云南德宏11月、云南德宏12月產草果。具體結果見表5。

3 討論

3.1 檢測條件的選擇

在建立GC方法時，本課題組考察了不同分流比（10∶1、20∶1、40∶1）、不同初始溫度（40、60、80 ℃）對色譜圖的影響。結果發現，當分流比為40∶1時，各色譜峰的峰形較好，而且初始溫度對色譜圖的影響較小。考慮運行時間的長短，故本研究最終選擇80℃為初始溫度。

3.2 草果的質量評價

熵權TOPSIS法結果顯示，11項指標的熵權系數（即權重）分別為0.150 7、0.086 9、0.074 1、0.121 6、0.088 8、0.084 9、0.093 1、0.057 8、0.079 1、0.108 9、0.054 1。其中，揮發油類成分所占權重均相對較高，故將揮發油類成分作為草果藥材質量評價的主要指標具有重要意義。進一步根據相對貼近度排序結果可知，草果質量排名前3位的分別是云南保山7月、云南紅河10月、云南文山9月產草果，由此推測，這幾個產地的草果質量較優；而質量排名后3位的分別是云南德宏9月、云南德宏11月、云南德宏12月產草果，表明云南德宏的草果質量相對較差。

綜上所述，在本研究所有樣品中，云南保山（7月）、紅河（10月）、文山（9月）產草果的質量相對較優。