清胰合劑的指紋圖譜建立及8種成分含量測定Δ

張璠璠，王轍遠，王隆隆，陳恒文，劉菊，黃霞，于曉濤，王瑞#（.漯河市中心醫院藥學部，河南 漯河 600；.中國中醫科學院廣安門醫院藥劑科，北京 0005；.鄭州市中醫院藥劑科，鄭州 50007；.河南省食品藥品檢驗所中藥研究室，鄭州 5000）

清胰合劑（Qingyi mixture，QM）是漯河市中心醫院消化內科醫生根據臨床經驗總結而成的有效經驗方，由枳實、砂仁、蒲公英、牡丹皮、黃芩、厚樸、地黃、丹參、大黃、川芎、陳皮、敗醬草共12味中藥組成。方中蒲公英能清熱解毒、消腫散結，尤善治濕熱癰滯，丹參能活血祛瘀、涼血消癰，二者共為君藥。全方理氣與行血相合，清熱與逐瘀共用，共奏逐瘀行血、清熱通腑之功。

QM于2021年獲得河南省醫療機構院內制劑備案批準文號（豫藥制備字Z20210113000），但其現行質量標準僅為簡單的薄層鑒別，無法有效反映該制劑的質量水平。為了有效控制該制劑的質量，筆者擬采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法建立該制劑的指紋圖譜，對其進行化學模式識別分析，同時擬測定該方君藥蒲公英中綠原酸、菊苣酸和丹參中丹酚酸B等8種有效成分的含量，從定性和定量2個角度為QM的質量標準研究提供科學依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有1260型HPLC儀（美國Agilent公司）、SB25-12D型超聲清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）、FAUW-120D型分析天平（日本Shimadzu公司）、5810R型高速離心機（德國Eppendorf公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

15批QM來自漯河市中心醫院，批號分別為20200715、20200812、20200908、20201008、20201120、20201230、20210202、20200310、20210420、20210610、20210710、20210811、20210909、20211009、20211115，編號為S1～S15，規格均為100 mL/瓶。枳實、砂仁、蒲公英、牡丹皮、黃芩、厚樸、地黃、丹參、大黃、川芎、陳皮、敗醬草藥材由漯河市中心醫院提供。綠原酸對照品（批號110753-201817，純度96.8%）、阿魏酸對照品（批號110773-201614，純度99.0%）、黃芩苷對照品（批號112002-201702，純度98.5%）、黃芩素對照品（批號111514-201706，純度98.9%）、丹皮酚對照品（批號110708-201407，純度99.9%）均購自中國食品藥品鑒定研究院；菊苣酸對照品（批號DSTDJ003901，純度98.54%）、橙皮苷對照品（批號DST200517-038，純度98.79%）、丹酚酸B對照品（批號DST190918-009，純度99.28%）均購自成都德斯特生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；磷酸為色譜純，購自天津科密歐化學試劑有限公司；水為飲用水或超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～10 min，11%B；10～20 min，11%B→19%B；20～50 min，19%B；50～60 min，19%B→28%B；60～75 min，28%B；75～95 min，28%B→55%B；95～100 min，55%B；100～101 min，55%B→11%B；101～110 min，11%B）；柱溫為35 ℃；流速為0.6 mL/min；檢測波長為254 nm；進樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚對照品各適量，加甲醇制成質量濃度分別為1.86、1.79、1.54、2.14、1.96、2.11、2.26、2.13 mg/mL 的單一對照品貯備液。精密量取以上各貯備液適量，混勻，制得綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚質量濃度分別為289.877、245.784、117.712、167.384、780.605、109.242、200.592、136.521 μg/mL的混合對照品溶液，密閉保存，備用。

2.2.2 供試品溶液 取15批QM各1 mL，以13 000 r/min離心3 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.2.3 單味飲片供試液 依據QM制備工藝（藥材加10倍量水浸泡40 min后煎煮90 min，再加8倍量水煎煮60 min）同法制備丹參、蒲公英、黃芩、牡丹皮等12味中藥的提取液，再按“2.2.2”項下方法制得各單味飲片供試液。

2.3QM指紋圖譜研究

2.3.1 精密度試驗 取供試品溶液（S1），按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖。以黃芩苷峰（峰14）為參照峰，測得各共有峰相對保留時間的RSD≤1.1%（n＝6），相對峰面積的RSD≤1.2%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一批樣品（S1），共6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以黃芩苷峰（峰14）為參照峰，測得各共有峰相對保留時間的RSD≤0.9%（n＝6），相對峰面積的RSD≤1.5%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液（S1），分別于室溫下放置0、3、9、24、48 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以黃芩苷峰（峰14）為參照峰，測得各共有峰相對保留時間的RSD≤1.2%（n＝5），相對峰面積的RSD≤1.4%（n＝5），表明供試品液在室溫下放置48 h內穩定。

2.3.4 指紋圖譜建立及相似度評價 取“2.2”項下15批供試品溶液（S1～S15）及混合對照品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。取S1～S15的色譜圖，通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》建立指紋圖譜[設定時間窗寬度0.1 min，進行多點校正和全譜峰匹配生成HPLC指紋圖譜，采用中位數法生成對照指紋圖譜（R），圖1]并進行相似度評價。結果顯示，15批QM與對照指紋圖譜的相似度均超過0.975；共標定了22個共有峰，其峰面積之和占總峰面積的86.74%，表明其能夠代表QM色譜圖的概況。色譜圖中黃芩苷峰（峰14）的保留時間適中、分離度好、峰面積較大且穩定，故以其作為參照峰（S），計算得15批QM各共有峰相對保留時間的RSD≤1.2%，表明15批QM的出峰時間相對穩定；各共有峰峰面積的RSD為2.96%～16.31%，表明15批QM所含成分存在批次間差異。

圖1 15批QM的HPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜

2.3.5 色譜峰的歸屬及指認 分別取混合對照品溶液、供試品溶液（S1）及單味飲片供試液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖2）。通過色譜圖比對，共歸屬了22個共有峰，指認了8個共有峰。其中，峰3、峰5歸屬于枳實，峰4（綠原酸）、峰9（菊苣酸）歸屬于蒲公英，峰22（丹皮酚）歸屬于牡丹皮，峰14（黃芩苷）、峰19、峰21（黃芩素）歸屬于黃芩，峰11、峰13、峰15（丹酚酸B）、峰16歸屬于丹參，峰7、峰12、峰17、峰18、峰20歸屬于大黃，峰6、峰8（阿魏酸）歸屬于川芎，峰10（橙皮苷）歸屬于陳皮，峰1為枳實、蒲公英、牡丹皮、地黃、大黃、川芎、陳皮和敗醬草的共有成分，峰2為牡丹皮、大黃和川芎的共有成分。

圖2 QM共有峰的歸屬及指認

2.4 化學模式識別分析

2.4.1 聚類分析 將22個共有峰的峰面積數據采用ZScore標準化處理后，通過SPSS 20.0軟件進行聚類分析。結果顯示，當平方歐氏距離為10時，可將15批QM聚為2類，其中S1～S4及S9、S10聚為一類，其余批次樣品聚為另一類（圖3）。這表明QM存在批次間差異，可能與中藥飲片產地、廠家、批次等存在差異有關，提示保持飲片來源及廠家穩定對QM的質控具有重要意義。

圖3 15批QM的聚類分析樹狀圖

2.4.2 主成分分析 將22個共有峰的峰面積數據采用Z-Score標準化處理后導入SIMCA 14.1軟件進行主成分分析[1]。以特征值≥1作為提取標準，共得到5個主成分，其累計方差貢獻率達到了93.6%，提示提取出的5個主成分能夠概括QM中絕大部分信息。15批QM可被分為2類，其中S1～S4及S9、S10為一類，其余批次樣品為另一類，與聚類分析結果一致，詳見圖4。

圖4 15批QM的主成分分析結果

2.4.3 正交偏最小二乘法-判別分析 將22個共有峰的峰面積數據采用Z-Score標準化處理后導入SIMCA 14.1軟件進行正交偏最小二乘法-判別分析，得到載荷散點圖、得分散點圖和變量投影重要性（variable importance of projection，VIP）圖，如圖5所示。由圖5可知，在置信區間（95%）范圍內，15批QM可被分為2類，其中S1～S4及S9、S10為一類，其余批次樣品為另一類，與聚類分析、主成分分析結果一致。載荷散點圖中每個點代表一個共有峰自變量，其與原點距離越近，對樣品差異的貢獻率越小，反之貢獻率就越大；而VIP圖可以篩選出導致樣品差異貢獻較大的成分[2－3]。本研究以VIP值≥1.0作為參考值，共提取出了5個特征性成分，依次為峰14（黃芩苷）、峰9（菊苣酸）、峰18、峰21（黃芩素）和峰19，說明這5種成分可能是造成QM質量差異的標志物。

圖5 15批QM的正交偏最小二乘法-判別分析結果

2.5 8種成分含量測定

2.5.1 專屬性試驗 取供試品溶液（S1）和混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，8種待測成分的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，峰形對稱性良好；理論板數以黃芩苷峰計算均大于6 000。在與綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚對照品色譜圖相對應的位置上，供試品溶液色譜圖中均有相應色譜峰出現（圖2B）。

2.5.2 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液，加甲醇逐級稀釋0、1.5、3、4.5、6、7倍，使之成為不同質量濃度的系列對照品混合溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以對照品質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，結果見表1。

表1 綠原酸等8種成分的線性關系考察結果

2.5.3 精密度試驗 精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄色譜圖。結果顯示，綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚峰面積的RSD均不大于1.8%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 取QM樣品（S1），共6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算樣品含量。結果顯示，綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚含量的RSD均不大于1.1%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.5.5 穩定性試驗 取同一供試品溶液（S1），在室溫下放置0、6、12、24、48 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚峰面積的RSD均不大于1.9%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內穩定。

2.5.6 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（S1）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備9份供試品溶液。精密量取“2.2.1”項下各對照品貯備液適量，制備與樣品中成分含量相同的混合對照品溶液。將該混合對照品溶液按樣品含量的0.5、1.0、1.5倍加至供試品溶液中，混勻，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚的平均加樣回收率為98.69%～101.99%，RSD≤2.0%（n＝9），表明方法準確度良好。

2.5.7 QM含量測定 取15批QM，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算樣品含量。每批樣品平行測定3次，取平均值。結果顯示，15批QM中綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚的含量分別為0.077～0.094、0.165～0.190、0.100～0.114、0.083～0.107、0.556～0.615、0.288～0.314、0.152～0.188、0.114～0.128 mg/g，詳見表2。

表2 15批QM中綠原酸等8種成分的含量測定結果（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 色譜條件考察

本研究前期考察了不同色譜柱（YMC C18、GLSciences ODS-3、Agilent SB-C18）、流動相（水-乙腈、0.2%磷酸溶液-乙腈、0.1%磷酸溶液-乙腈）、柱溫（40、35、30℃）、流速（1.0、0.8、0.6 mL/min）、檢測波長（220、254、276 nm）對色譜圖的影響。結果顯示，在以Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱、0.1%磷酸溶液-乙腈為流動相（梯度洗脫）、柱溫為35℃、流速為0.6 mL/min、檢測波長為254 nm時，供試品溶液的整體色譜圖基線平穩，色譜峰大小適中、分離度較高且分布較為合理，故選其作為本研究的色譜條件。

3.2 指標成分的選定

本研究比對了供試品溶液、單味飲片供試液及混合對照品溶液的色譜圖信息，確認了22個共有峰的歸屬情況，指認了綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚8種成分的色譜峰；正交偏最小二乘法-判別分析以VIP值≥1.0作為提取特征，共篩選出5種成分，分別為峰9（菊苣酸）、峰14（黃芩苷）、峰18、峰19、峰21（黃芩素）。結合文獻資料及中藥活性成分的藥理作用研究可知，蒲公英中的綠原酸、菊苣酸在抗菌、抗炎等方面有較強的藥理活性[4]；陳皮中的橙皮苷具有保護心血管、抗炎、抗菌、抗氧化等多種藥理活性[5]；川芎中的阿魏酸具有抗氧化、抗血栓、降血脂、降低心肌缺血和耗氧量、抗菌、抗病毒、抗癌等作用[6]；黃芩中的黃芩苷和黃芩素具有清熱瀉火、抗炎、抗病毒等藥理活性[7]；丹酚酸B為丹參中主要的水溶性成分，具有抗氧化、清除自由基、抑制細胞凋亡等藥理活性[8]；丹皮酚為牡丹皮中主要有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、代謝調節、鎮痛等藥理作用[9]。以上化學成分的藥理活性均與本方抗炎、解痙、止痛、改善微循環等治療理念聯系緊密，故選擇以上8種成分進行含量測定，以期為QM的質量標準研究提供參考。

綜上，本研究建立了QM的HPLC指紋圖譜和方中8種成分含量測定的方法，可為該制劑的質量標準研究提供參考依據。