mTOR-4EBP1/p70S6K1信號通路在良、惡性胸腔積液中的表達研究

李燕明，王翠峰，任美英

1.內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古包頭 014010；2.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院檢驗科，內蒙古包頭 014010

胸腔積液是臨床上常見的癥狀。惡性腫瘤轉移、炎癥刺激以及循環障礙等病理狀況是引起胸腔積液的主要病因[1]。近年來積液的診斷方法包括了影像學檢查和實驗室檢查。胸腔積液脫落細胞學是目前臨床上最常用來診斷惡性胸腔積液(MPE)的實驗室方法，其特異度可高達89%～98%，但因受多種因素影響，靈敏度只有40%～80%[2]，假陰性率為31.5%[3]。探尋彌補其不足之處的新胸腔積液診斷靶標勢在必行。有研究表明，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-真核啟動因子4E結合蛋白1(4EBP1 )/核糖體蛋白S6激酶1(p70S6K1)信號通路在腫瘤的發生發展中發揮重要的作用[4]。本研究從分子水平探討該信號通路在良惡性胸腔積液中的表達差異，期待為MPE的發生機制及診療靶標研究提供新思路、新方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院2020年1月至2021年1月符合病例納入標準及試驗要求的131例胸腔積液標本。通過患者的臨床資料結合胸膜活檢病理結果或胸腔積液脫落細胞學檢查結合免疫組化結果，明確上述131例積液的良、惡性質后，從中選取44例良性胸腔積液(BPE)標本為良性對照組，44例MPE標本為惡性測定組。惡性測定組中男22例，女22例；年齡23～80歲，中位年齡73歲；肺癌32例，乳腺癌5例，消化道腫瘤4例，淋巴瘤2例，膀胱癌1例。良性對照組中男32例，女12例；年齡18～75歲，中位年齡70歲；肺炎旁積液22例，結核性胸膜炎11例，充血性心力衰竭11例。惡性測定組與良性對照組年齡差異無統計學意義(P>0.05)。對標本進行RT-PCR檢測、Western-blot檢測。

病例納入標準：(1)確認有胸腔積液的患者；(2)所有患者均經病理及臨床資料診斷明確；(3)既往未經過放療及化療的患者；(4)病例資料無遺漏的患者。排除標準：(1)診斷不明的胸腔積液標本；(2)患者胸腔積液病因復雜，合并多種疾病者。

病例分組標準：(1)良性對照組入組標準。肺炎旁胸腔積液的診斷標準為肺膿腫、肺炎和感染引起的胸腔積液。結核性胸膜炎的診斷標準為胸膜涂片檢出抗酸桿菌和結核分枝桿菌，胸膜活檢病理檢查結果顯示為結核引起的胸腔積液。充血性心力衰竭所引起的胸腔積液只能依據患者的病史、體征、心電圖、超聲心動圖等輔助檢查來診斷。(2)惡性測定組入組標準：在胸腔積液脫落細胞中找到惡性腫瘤細胞，或在胸膜活檢組織中看到惡性腫瘤細胞的病理變化。

1.2主要試劑和儀器 實時熒光定量PCR反應試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；Western blot相關抗體[GAPDH、mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、4EBP1、磷酸化4EBP1(p-4EBP1)、p70S6K1、磷酸化p70S6K1(p-p70S6K1)兔多克隆抗體、HRP標記山羊抗兔IgG抗體，Cell Signaling公司]；BCA蛋白濃度測定試劑盒(包含BSA標準品)、牛血清清蛋白(BSA，北京索萊寶科技有限公司)。液基薄層制片機(中國湖北德里森實業有限公司)、RT-PCR分析儀(Applied Biosystems 7900 Fast)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集 收集符合要求的胸腔積液40 mL，分別置于2支試管中，每支20 mL。以2 000 r/min離心5 min，保存沉渣并標記。放置于-80 ℃冰箱中，用于RT-qPCR及Western blot檢測。

1.3.2提取總RNA (1)向分裝處理好的標本中加入500 μL細胞裂解液和10 μL ProteinaseK，室溫下靜置15 min。4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，保留上清液并將其轉入基因組去除柱中。(2)將基因組去除柱離心2 min，留取濾液。(3)向濾液中加入70%乙醇(加入體積與上清液相同)，將其混勻，將處理好的混合液轉入RNase Free吸附柱中，經12 000 r/min離心2 min后將廢液倒掉。(4)將500 μL蛋白去除液加入吸附柱中，高速離心2 min，倒出廢液。(5)將500 μL沖洗液加入吸附柱中，室溫條件下靜置5 min，離心2 min，丟棄廢液，再次沖洗離心一遍。(6)將吸附柱在室溫下靜置2 min晾干。(7)將吸附柱轉移入RNA收集管中，滴加30 μL RNase-Free ddH2O，靜置5 min后在12 000 r/min離心2 min，得到RNA溶液。(8)分光光度法檢測RNA濃度。

1.3.3逆轉錄 (1)RNA變性：50 ℃放置2 min，置于冰上冷卻；(2)逆轉錄：95 ℃、1 min，結束后將cDNA保存于-20 ℃冰箱保存。

1.3.4實時熒光定量PCR (1)引物：β-actin上游，5′-TCC CTG GAG AAG AGC TAC GA-3′；下游，5′-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3′。mTOR上游，5′-CGC TGT CAT CCC TTT ATC G-3′；下游，5′-ATG CTC AAA CAC CTC CAC C-3。4EBP1上游，5′-CAA GGG ATC TGC CCA CCA TT-3′；下游，5′-ACA CGA TGG CTG GTG CTT TA-3′。p70S6K1上游，5′-AAG GGG GCT ATG GAA AGG CAA-3′；下游，5′-TTT CCA CCA GTC TGA AAG GCA T-3′。(2)反應體系：TBGreenPremix Ex Taq Ⅱ(10 μL)，上游和下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×，0.4 μL)，cDNA模板(2 μL)，dH2O(6 μL)。(3)擴增：50 ℃、2 min；95 ℃、1 min；95 ℃、15 s；59 ℃、30 s；74 ℃、30 s；72 ℃、2 min，共40個循環。記錄擴增曲線、熔解曲線、循環閾值(Ct)，采用ΔΔCt=2-ΔΔCt法計算mTOR、4EBP1和p70S6K1 mRNA相對表達量。

1.4Western blot檢測蛋白表達水平 將收集好的胸腔積液標本由-80 ℃冰箱取出復溶，混勻后用新的EP管分裝標本，每管取100 μL并按順序編號，置于冰上備用。將400 μL細胞蛋白裂解液(含PMSF)加入分裝好的標本中，在冰上放置25 min，期間需研磨。在12 000 r/min條件下，將標本放入4 ℃低溫超速離心機中離心10 min，取上清液，用BCA法測定其蛋白濃度。將蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，進行10% SDS-PAGE電泳、轉膜，用5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，分別加入GAPDH(1∶10 000)、mTOR(1∶500)、p-mTOR(1∶500)，4EBP1(1∶1 000)、p-4EBP1(1∶1 000)、p70S6K1(1∶1 000)、p-p70S6K1(1∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜。一抗孵育結束后，室溫搖床上用TBST洗3次，稀釋HRP(1∶5 000)37 ℃室溫孵育2 h，用ECL化學發光法顯影。Image J軟件進行灰度值數據測定。

1.5統計學處理 采用SPSS23.0統計軟件進行統計分析。非正態分布的計量資料用M(P25,P75)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。PCR數據采用ΔΔCt=2-ΔΔCt均一化方法處理，Western blot蛋白條帶采用Image J 進行灰度值數據測定。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1mTOR、4EBP1、p70S6K1 mRNA表達情況 RT-qPCR顯示，惡性測定組mTOR、4EBP1、p70S6K1的mRNA表達水平均高于良性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組胸腔積液內 mTOR、4EBP1、p70S6K1 mRNA表達水平比較[M(P25,P75)]

2.2mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、p70S6K1、p-p70S6K1蛋白表達情況 Western blot顯示，兩組胸腔積液內mTOR、4EBP1、p70S6K1蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05 ) 。惡性測定組p-mTOR、p-4EBP1、p-p70S6K1蛋白表達水平高于良性對照組，差異均有統計學意義(P<0.05) 。見表2、圖1。

圖1 Western blot檢測兩組胸腔積液內各蛋白的表達

表2 兩組胸腔積液內mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、p70S6K1、p-p70S6K1蛋白表達水平比較[M(P25,P75)]

3 討 論

在惡性腫瘤中，最常見的引起胸膜轉移癌的是肺癌，其次是乳腺癌、惡性淋巴瘤，胃癌、結直腸癌等較少見[5]。MPE通常是胸膜轉移癌患者的首發癥狀，也是晚期腫瘤患者的預后影響因素。MPE的存在通常意味著患者疾病進入晚期[6]，中位生存期一般為3～12個月[7]，腫瘤伴MPE的患者病死率高于無MPE的患者[8]。盡早確定胸腔積液的性質對下一步治療有很重要的參考價值。目前臨床上常用的診斷MPE的有效方法仍是脫落細胞形態學檢查。由于胸腔積液的脫落細胞存在非典型性的形態，增生的間皮細胞與分化良好的腺癌細胞在形態上難以鑒別，從而造成結果的誤判，使得液基薄層細胞檢測(TCT)的特異度高，但靈敏度低。由于TCT診斷性能評價仍存在不足，探尋彌補其不足之處的新胸腔積液診斷靶標勢在必行。

mTOR-4EBP1/p70S6K1信號通路在細胞的生長、增殖、分化及蛋白質的合成過程中占據重要地位。mTOR是一種重要的進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其作為多條信號通路匯聚的交點，可整合各通路傳遞的信息并對細胞生長、增殖、存活及自噬等過程作出相應調節。在腫瘤患者中mTOR信號在多種因子的刺激下過度激活為p-mTOR；在p-mTOR的作用下，下游的兩個重要因子4EBP1和p70S6K1磷酸化(p-4EBP1、p-p70S6K1)[9-10]，p-4EBP1失去與真核細胞翻譯啟動因子4E(eIF4E)結合的能力，eIF4E與亞單位eIF4G、eIF4A和eIF4B結合形成eIF4F復合物，加速Cap-依賴型的mRNA的翻譯過程；p-p70S6K1可磷酸化S6核糖體蛋白，從而使5′TOP結構的mRNA的翻譯過程加快；兩者發揮作用促進腫瘤細胞的形成與增殖。本研究通過對mTOR-4EBP1/p70S6K1信號通路在良惡性胸腔積液中的表達進行檢測，從分子水平上探明此信號通路在BPE及MPE中均有表達，且根據其基因和蛋白水平表達的趨勢變化可以初步推測是通過激活了mTOR進而使4EBP1、p70S6K1磷酸化，來調節胸腔積液中惡性細胞的生長、增殖。

本研究顯示，惡性測定組的mTOR、4EBP1及p70S6K1 mRNA的表達水平高于良性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。這與此信號通路對原發腫瘤細胞代謝的調節相一致[11]。同時，本研究顯示，惡性測定組p-mTOR、p-4EBP1、p-p70S6K1蛋白表達水平明顯高于良性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；mTOR、4EBP1、p70S6K1在惡性測定組中的表達水平稍高于良性對照組，變化趨勢與磷酸化后一致，但差異無統計學意義(P>0.05)。可能原因為MPE中，p-mTOR具有活性，從而刺激4EBP1上的Thr37/46、Thr70、Ser65位點，使得4EBP1變成磷酸化形式(p-4EBP1)，p-4EBP1失去與eIF4E結合的能力，eIF4E與亞單位eIF4G、eIF4A和eIF4B結合形成eIF4F復合物，加速Cap-依賴型的mRNA的翻譯過程[12]，促進腫瘤細胞的形成與增殖。p-mTOR的過度活化刺激p70S6K1上的Thr389位點，使其成為磷酸化形式(p-p70S6K1)，從而具備生物學活性發揮作用，p-p70S6K1可磷酸化S6核糖體蛋白，從而使5′TOP結構的mRNA的翻譯過程加快[13]。mTOR、4EBP1及p70S6K1信號分子在基因層面和蛋白層面的表達變化相一致，也與該信號通路在其他腫瘤細胞中變化相一致[14]。

綜上所述，mTOR-4EBP1/p70S6K1信號通路在BPE和MPE中表達存在差異，在腫瘤細胞的生長、代謝及其轉移中該信號通路發揮著重要作用，可作為新的分子靶標，對臨床鑒別診斷胸腔積液的性質具有提示性作用。對于此信號通路在胸腔積液中的具體調節機制仍需進一步研究。