人腦膠質瘤組織Six1、IGF2蛋白表達與臨床病理特征、細胞增殖和預后的關系

趙 樂，李 濤

陜西省榆林市第二醫院神經外科，陜西榆林 719000

人腦膠質瘤是中樞神經系統常見的惡性腫瘤，其發病率占全部顱內腫瘤的35%～60%，全球每年約有19萬新發病患者，但僅有5%的患者生存時間超過5年，具有發病率高、復發率高、病死率高以及治愈率低的特點，嚴重威脅患者生命健康[1]。目前，臨床診斷人腦膠質瘤主要依靠影像學檢查及術后病理診斷，雖能幫助大部分患者確診，但在臨床鑒別和分級中仍存在一定局限性，影響其診斷價值[2]。隨著分子病理診斷學的發展，生物標志物檢查被逐漸應用于臨床診斷中樞神經系統疾病。同源異形框基因為轉錄調控因子，具有特異性調節基因的表達作用，其中Six1在細胞增殖、分化、黏附等細胞生理功能中發揮重要作用，據臨床研究發現，乳腺癌[3]、肝癌[4]等諸多惡性腫瘤患者中存在Six1的異常高表達。胰島素樣生長因子-2(IGF2)為胚胎生長因子，近年來有研究證實IGF2的表達與腫瘤的良惡性相關，且在結直腸癌[5]、非小細胞肺癌[6]等腫瘤組織中呈高表達。本研究通過探討人腦膠質瘤組織Six1、IGF2蛋白表達與臨床病理特征、細胞增殖和預后的關系，以期為臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年1月在本院接受診治的人腦膠質瘤患者切除的瘤組織80例設為觀察組，另選取同期本院收治的非腦瘤患者手術切除的腦組織40例設為對照組。對照組患者年齡15～75歲，平均(53.34±7.12)歲；男22例，女18例。觀察組患者年齡12～72歲，平均(52.63±6.75)歲；男44例，女36例。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院倫理委員會審核批準，所有研究對象均簽署知情同意書。納入標準：(1)根據臨床癥狀、體征檢查確診為人腦膠質瘤[7]，并行手術切除治療患者；(2)術前未進行放療、化療治療者；(3)臨床病歷資料完整者。排除標準：(1)嚴重心、肝、腎功能不全者；(2)合并其他惡性腫瘤者；(3)既往有精神疾病者；(4)合并有活動性感染、血液系統疾病者。

1.2主要試劑 兔抗人IGF2、Six1單克隆抗體均購自美國Abcam公司，熒光定量試劑盒、逆轉錄試劑盒和免疫組化試劑盒均購自北京中衫金橋生物技術有限公司。

1.3方法 采用SP免疫組化法檢測Six1、IGF2蛋白免疫反應性。使用10%甲醇溶液固定標本，采用石蠟包埋，將標本切成5 μm薄片后進行脫水處理、EDTA抗原修復液高壓修復之后，使用3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶30 min，加入1∶500濃度的兔抗人一抗4 ℃過夜。過夜取出后室溫恢復，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，加入兔抗人二抗37 ℃孵育30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒顯色后蘇木精復染，隨后封片，整個SP免疫組化過程嚴格按照說明書操作步驟進行。試驗過程中，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4結果判定 Six1、IGF2蛋白陽性信號均定位在細胞質內，陽性細胞為呈棕黃色或棕褐色顆粒。(1)根據陽性細胞染色強度進行結果判定：0分為染色強度無色；1分為淡黃色(弱陽性)；2分為棕黃色(中等強度)；3分為棕褐色(強陽性)。(2)根據陽性細胞百分比進行結果判定：0分為陽性細胞占比0%；1分為陽性細胞占比<0%～10%；2分為陽性細胞占>10%～49%；3分為陽性細胞占>49%～75%；4分為陽性細胞占比>75%。(3)染色指數=陽性細胞染色強度評分×陽性細胞百分比評分：染色指數0分為陰性表達(-)；染色指數1～2分為低陽性表達(+)；染色指數3～5分為中陽性表達(++)；染色指數>6分為高陽性表達(+++)[8]。增殖細胞核抗原(PCNA)與Ki-67陽性信號均位于細胞核中。PCNA、Ki-67標記指數(LI)判斷標準：隨機選擇10個400倍視野進行細胞計數，一共計數>1 000個細胞的基礎上計算LI(計數時不包括血管內皮陽性細胞)。LI(%)=陽性細胞數/總計數細胞數×100%[9]。

1.5隨訪 采用電話聯系或者門診復查的方式對研究對象進行36個月的隨訪，隨訪時間至2021年1月。將患者第1次手術時間至死亡日期或隨訪截止日期視為總生存時間(OS)。

2 結 果

2.1兩組Six1、IGF2蛋白陽性表達情況比較 觀察組Six1、IGF2蛋白陽性表達率均明顯高于對照組(P<0.05)，見表1、表2。

表1 兩組Six1蛋白陽性表達情況比較[n(%)]

表2 兩組IGF2蛋白陽性表達情況比較[n(%)]

2.2人腦膠質瘤組織Six1、IGF2蛋白表達與患者臨床病理特征的關系 Six1、IGF2蛋白陽性表達在人腦膠質瘤患者不同病理類型、腫瘤最大徑、腫瘤病理分級、年齡、性別之間差異無統計學意義(P>0.05)；Six1、IGF2蛋白陽性表達率在人腦膠質瘤患者不同腫瘤分化程度間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且腫瘤分化程度越低，Six1、IGF2蛋白陽性表達率越高(P<0.05)，見表3。

表3 Six1、IGF2蛋白表達與人腦膠質瘤患者臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3人腦膠質瘤組織Six1、IGF2蛋白表達與Ki-67 LI、PCNA LI的關系 Six1蛋白陽性表達患者的Ki-67 LI、PCNA LI均明顯高于Six1蛋白陰性表達患者(P<0.05)，且隨著Six1蛋白陽性表達程度的增加，Ki-67、PCNA LI隨之升高(P<0.05)，見表4。

表4 人腦膠質瘤組織Six1、IGF2蛋白表達與Ki-67 LI、PCNA LI的關系

2.4Six1與IGF2蛋白在人腦膠質瘤組織中表達水平的相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示，Six1與IGF2蛋白在人腦膠質瘤組織中表達水平呈正相關(r=0.399，P<0.05)。

2.5人腦膠質瘤組織Six1、IGF2蛋白表達與患者預后的關系 3年的隨訪結束后共獲訪76例，失訪4例，76例患者中死亡41例，生存35例。Six1蛋白陰性表達患者的生存率為62.96%(17/27)，高于Six1蛋白陽性表達患者的36.73%(18/49)，差異有統計學意義(Log-rankχ2=4.029，P=0.045)；IGF2蛋白陰性表達患者的生存率為57.50%(23/40)，高于IGF2蛋白陽性表達患者的33.33%(12/36)，差異有統計學意義(Log-rankχ2=4.903，P=0.027)。

2.6COX回歸分析人腦膠質瘤患者預后的影響因素 建立COX比例風險回歸模型(逐步后退法，α保留=0.05，α剔除=0.10)，以人腦膠質瘤患者預后狀況為應變量，賦值1=死亡，0=生存，t=生存期。自變量為腫瘤分化程度、IGF2蛋白表達情況、Six1蛋白表達情況，賦值見表5。回歸結果顯示，低腫瘤分化程度、IGF2陽性表達、Six1陽性表達均是影響膠質瘤患者預后的危險因素(P<0.05)，見表6。

表5 COX回歸自變量賦值情況

表6 人腦膠質瘤患者預后的影響因素分析

3 討 論

人腦膠質瘤是中樞神經系統常見惡性腫瘤，發病率占成人顱內腫瘤的40%，其以浸潤性方式生長，導致手術治療難以完全切除瘤體，治療效果差，患者具有較高的病死率[10-11]。隨著分子生物學檢測技術的不斷發展，研究者逐漸開始從腫瘤組織蛋白質分子表達等角度進一步了解膠質瘤發病機制，為臨床進行生物靶點治療或判斷膠質瘤患者預后提供參考。Six是一類特殊的轉錄調控因子，參與調控特異性基因表達，Six1作為Six家族的重要成員，在乳腺癌中可通過HBO1和AIB1組蛋白乙酰轉移酶調節糖酵解，促進體外和體內的Warburg效應和腫瘤生長[12]。胰島素樣生長因子(IGF)是一類功能細胞調控因子，其分泌細胞廣泛分布在人體肝、腎、肺、腦等組織中，IGF2是肝臟和許多其他組織產生的一種相對分子質量為7.5×103的肽，具有家族一系列典型生物學特性，對細胞的增殖分化發揮一定作用[13]。

本研究結果發現，人腦膠質瘤患者Six1、IGF2蛋白陽性表達率均明顯高于同期非腦瘤患者，呈高水平表達；低分化人腦膠質瘤患者Six1、IGF2蛋白陽性表達率明顯高于中、高分化人腦膠質瘤患者。提示人腦膠質瘤分化程度越低，Six1、IGF2蛋白陽性表達率越高，進一步提示Six1、IGF2蛋白表達與人腦膠質瘤的發生發展密切相關。這可能與兩者在細胞的增殖、分化、遷移、黏附、凋亡中發揮重要作用有關。臨床研究發現，過度表達的Six1能夠逆轉由過度表達的微小RNA(miR)-155-3p誘導的細胞凋亡所引起的細胞周期分布、增殖，而miR-155-3p可通過調節Six1的表達，促進膠質母細胞瘤的進展[14]。王文斐等[15]的研究表明，IGF2在膠質瘤的發生發展中發揮一定的作用，且其表達隨著病理分級的增加而升高。

腫瘤細胞增殖是反映腫瘤惡性程度的重要指標，與腫瘤的發生發展、浸潤、轉移密切相關，細胞的惡性增殖是腫瘤的重要特征。PCNA、Ki-67均為增殖細胞相關的核抗原，能夠有效反映細胞增殖的活躍程度[16]。本研究結果發現，Six1、IGF2蛋白陽性表達患者Ki-67 LI、PCNA LI均明顯高于其陰性表達患者，且隨著Six1、IGF2蛋白陽性表達程度增加，Ki-67 LI、PCNA LI隨之升高。提示Six1、IGF2蛋白表達與人腦膠質瘤細胞增殖活躍程度密切相關，在腫瘤細胞增殖中發揮重要作用。Six1基因主要定位于人染色體14q23上，產物蛋白由同源異型結構域N-末端與Six結構域組成，與DNA特定結合后調節下游基因表達[17]。近年來研究發現，Six1是轉錄因子E2F1的轉錄靶基因，將轉錄活性維持在有絲分裂早期，對細胞的增殖、分化等方面起重要的作用，Six1蛋白在多種腫瘤中表達上調，活化細胞周期調節因子，促進腫瘤細胞增殖、浸潤，從而在腫瘤的發生發展中發揮重要作用[18]。IGF2基因為內源性印記基因，據研究證實，IGF2基因的印跡丟失易引起IGF2蛋白過度表達，從而抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤細胞增殖、轉化[19]。

本研究結果還發現，Six1、IGF2蛋白陽性表達患者隨訪3年的生存率明顯低于Six1蛋白陰性表達患者(P<0.05)。COX回歸分析結果顯示，低腫瘤分化程度、IGF2陽性表達、Six1陽性表達均是影響人腦膠質瘤患者預后的危險因素。提示Six1、IGF2蛋白可作為評估患者預后的有效指標，對患者預后有顯著影響，Six1、IGF2蛋白陽性表達患者的預后較差。LI等[12]也證實了Six1可以通過調節糖酵解促進腫瘤生長。IGF2蛋白通過與受體結合介導RELA/p65、MAPK/ERK/Raf/Ras等通路，經甲硫氨酸腦啡肽信號傳導上調腫瘤細胞血管內皮生長因子水平，對調節腫瘤組織血管生成起到關鍵作用，從而促進腫瘤的生長、浸潤，患者往往預后不良[20]。本研究Pearson相關分析結果顯示，Six1與IGF2蛋白在人腦膠質瘤組織中表達水平呈正相關(P<0.05)。提示Six1、IGF2蛋白兩者在人腦膠質瘤患者組織的表達情況可作為判斷預后的生物標志物，二者聯合檢測可能成為人腦膠質瘤生物標記的新指標，亦可能成為人腦膠質瘤基因治療的潛在靶點，為臨床制訂更為合理和有效的治療方案提供依據。

綜上所述，Six1、IGF2蛋白在人腦膠質瘤患者組織中呈高表達，且腫瘤分化程度越低，腫瘤細胞增殖越活躍，Six1、IGF2蛋白陽性表達率越高。Six1、IGF2蛋白陽性表達患者的生存期較短，預后較差。