桂西地區(qū)壯族非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性分析*

韋禮肥，黃林達(dá)，陸相磊，楊 潔，王興枝子，龍喜帶，朱曉瑩

右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科/右江民族醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷與研究中心/廣西分子病理學(xué)(肝膽疾病)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西百色 533000

肺癌是威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，肺癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌，病死率最高的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要類型，占肺癌的80%～85%[1-2]。近年來，隨著對(duì)肺癌分子分型的深入研究，肺癌的靶向藥物研究發(fā)展迅速，患者的無進(jìn)展生存期、總生存期延長(zhǎng)，生活質(zhì)量明顯改善。明確患者人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因突變狀態(tài)，有助于篩選出合適的人群，開展靶向治療，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。目前已有研究報(bào)道，中國不同地區(qū)不同民族肺癌患者EGFR突變的類型及突變率存在差異[3]。桂西地區(qū)群眾以壯族人口為主，本研究通過檢測(cè)桂西地區(qū)壯族肺癌患者EGFR基因突變情況，進(jìn)一步分析其與肺癌組織分型、患者性別、年齡等臨床病理特征的相關(guān)性，為本地區(qū)NSCLC患者EGFR突變檢測(cè)分析提供可靠的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年3月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診并經(jīng)病理組織學(xué)確診的269例NSCLC患者為研究對(duì)象，納入研究對(duì)象為長(zhǎng)期居住在百色、河池等桂西地區(qū)的壯族人群。其中男164例，女105例；年齡34～84歲，中位年齡59歲；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期28例(10.4%)，Ⅲ～Ⅳ期241例(89.6%)；未發(fā)生轉(zhuǎn)移86例(32.0%)，單發(fā)轉(zhuǎn)移62例(23.0%)，多發(fā)轉(zhuǎn)移121例(45.0%)；研究樣本來源于手術(shù)標(biāo)本34例(12.6%)，支氣管鏡活檢/穿刺標(biāo)本186例(69.1%)，胸腔積液標(biāo)本49例(18.3%)；建立含患者年齡、性別、組織分型、吸煙史及臨床分期的資料庫。所有患者均知曉基因檢測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)和意義，并簽署了知情同意書。患者組織分型參照文獻(xiàn)[4]，由2名病理專家閱片確診為NSCLC(其中肺腺癌233例，肺鱗癌36例)。臨床分期依據(jù)文獻(xiàn)[5]。

1.2試劑和儀器 石蠟包埋組織(FFPE)DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司)；ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本質(zhì)控 所有標(biāo)本離體30 min以內(nèi)，經(jīng)10%甲醇固定、脫水、石蠟包埋、切片及HE染色。行基因突變檢測(cè)的組織由高年資病理醫(yī)生評(píng)估腫瘤細(xì)胞占比，選取腫瘤細(xì)胞占比>20%的腫瘤標(biāo)本，切取5～8張5 μm厚的蠟卷，置于滅菌EP管內(nèi)，嚴(yán)格按照FFPE DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取。

1.3.2DNA 濃度及純度鑒定 提取標(biāo)本DNA濃度>5 ng/μL，A260 nm/280 nm在1.8～2.2為合格標(biāo)本，才能進(jìn)行下一步檢測(cè)。

1.3.3EGFR基因突變檢測(cè) 采用突變擴(kuò)增系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)(ARMS-PCR)法對(duì)EGFR基因18～21外顯子突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，所有檢測(cè)均設(shè)陰、陽性對(duì)照。操作均在標(biāo)準(zhǔn)PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，并嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室相關(guān)SOP開展試驗(yàn)。

1.4隨訪 以電話隨訪為主要方式，失訪患者以末次住院時(shí)間作為末次隨訪時(shí)間。隨訪時(shí)間為1～30個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為 6個(gè)月。隨訪截止時(shí)間為2021年7月30日。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS24.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法；EGFR基因突變與臨床病理特征關(guān)系分析采用Logistic回歸分析；總生存時(shí)間(OS)定義為從確診NSCLC到死亡或最后一次隨訪的時(shí)間，采用Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC患者EGFR基因突變分析 NSCLC患者臨床特點(diǎn)、臨床分期、組織分型見表1。269例NSCLC壯族患者中EGFR突變例數(shù)為109例(EGFR突變組)，總突變率為40.52%(109/269)；其余160例為EGFR野生組。在EGFR基因突變標(biāo)本中，女性的突變率顯著高于男性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)；EGFR在肺腺癌中的突變率顯著高于肺鱗癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而年齡、吸煙史、臨床分期、標(biāo)本類型等臨床病理特征在組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 NSCLC患者臨床病理特征分析[n(%)]

續(xù)表1 NSCLC患者臨床病理特征分析[n(%)]

2.2NSCLC患者EGFR基因突變類型分析 269例NSCLC患者中檢出EGFR基因突變109例，以單一突變位點(diǎn)為主，在總體突變中占91.7%(100/109)。最常見的突變位點(diǎn)為19-Del和21-L858R，分別占總體突變的55.0%(60/109)和29.4%(32/109)；原發(fā)T790M突變有4例，突變率為3.6%(4/109)；G719X和L861Q突變分別有1例，突變率為0.9%(1/109)；20-Ins突變有2例，突變率為1.8%(2/109))；19-Del+T790M雙突變有6例，其中原發(fā)性和繼發(fā)性各3例，占總體突變的5.5%(6/109)，原發(fā)性L858R+T790M雙突變3例。見表2。

表2 NSCLC患者EGFR基因突變分析

2.3EGFR基因突變與臨床病理特征的Logistic回歸分析 將患者性別、年齡、組織分型、吸煙史、臨床分期、合并癥和轉(zhuǎn)移情況納入多元Logistic回歸分析模型中，結(jié)果顯示，不同年齡、性別和組織分型患者的EGFR基因突變率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而吸煙史、臨床分期、合并癥和轉(zhuǎn)移情況與EGFR基因突變率無關(guān)(P>0.05)。剔除無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義因素，重新選擇性別和組織分型進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示在α=0.05時(shí)，性別的OR值為0.57(P=0.034)，即在其他因素固定的情況下，男性EGFR基因突變風(fēng)險(xiǎn)是女性的0.57倍。見表3。

表3 影響EGFR基因突變的Logistic回歸分析

2.4NSCLC患者EGFR基因突變與OS的關(guān)系 通過EGFR基因突變列隊(duì)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療后EGFR突變組中位OS為12個(gè)月(95%CI：9.34～14.66)，EGFR野生組的中位OS為6個(gè)月(95%CI：5.03～6.96)。同時(shí)作EGFR基因突變的OS生存曲線，結(jié)果顯示，EGFR突變組的生存率和野生組明顯不同，EGFR突變組的總生存率高于EGFR野生組(P<0.001)。

3 討 論

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)發(fā)展，腫瘤靶向治療日益普及和下沉基礎(chǔ)研究，分子診斷成為輔助臨床診斷和指導(dǎo)臨床靶向治療的重要手段[6]。EGFR的生物學(xué)特性為跨膜糖蛋白受體，EGFR的高表達(dá)/突變，可引起下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)/持續(xù)活化，從而使得腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖、抗凋亡和侵襲性等作用[7]。靶向藥物EGFR-TKI治療NSCLC患者，具有較好的療效和較好的生存獲益，已經(jīng)成為NSCLC患者一線治療手段[8]。《非小細(xì)胞肺癌分子病理檢測(cè)臨床實(shí)踐指南(2021版)》中指出EGFR基因是中國NSCLC患者分子變異譜的主要基因，變異率達(dá)45%～55%[9]。

本研究回顧性分析了桂西地區(qū)壯族人群269例NSCLC患者EGFR基因突變情況，其突變率為40.52%(109/269)，其中腺癌突變率為45.5%(106/233)，肺鱗癌突變率為8.3%(3/36)，突變以單一位點(diǎn)突變?yōu)橹鳎畛Ｒ娡蛔兾稽c(diǎn)是19-Del(55.0%)和21-L858R(29.4%)，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10-12]。桂西地區(qū)壯族NSCLC患者EGFR突變常見于女性肺腺癌患者，與患者年齡、臨床分期、轉(zhuǎn)移情況等均無關(guān)。此外，不同送檢標(biāo)本中，胸腔積液、活檢/穿刺標(biāo)本的檢測(cè)率略高于手術(shù)標(biāo)本，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，考慮為手術(shù)標(biāo)本例數(shù)較少，不具有代表性。另外，本研究檢測(cè)前對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行嚴(yán)格的病理質(zhì)控，腫瘤細(xì)胞占比不能低于20%，如未能質(zhì)控合格，不予檢測(cè)。

通過對(duì)年齡、性別、吸煙史、組織分型等多個(gè)臨床病理因素進(jìn)行多元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，性別和組織分型是EGFR基因突變的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。這與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道一致，但與國外文獻(xiàn)報(bào)道有所出入，考慮可能原因?yàn)檠芯繉?duì)象例數(shù)較少以及構(gòu)成不同，需納入更多研究數(shù)據(jù)開展進(jìn)一步研究[13-14]。

在臨床隨訪過程中，EGFR基因突變的患者有9例由于經(jīng)濟(jì)原因放棄治療，其余患者接收了EGFR-TKI治療，有5例患者對(duì)EGFR-TKI不敏感，考慮除了EGFR基因突變外，可能合并有KRAS、MET等基因突變[15-16]。但由于其他原因未能開展進(jìn)一步檢測(cè)。通過隨訪分析EGFR突變組經(jīng)靶向治療的效果，其中位OS為12個(gè)月，EGFR野生組為6個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，桂西地區(qū)壯族NSCLC患者EGFR基因突變主要影響因素為性別和組織分型。EGFR基因突變檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)臨床靶向治療效果顯著，其中女性肺腺癌患者更易從EGFR-TKI治療中獲益。為進(jìn)一步了解桂西地區(qū)NSCLC患者基因突變情況，今后需進(jìn)一步積累樣本數(shù)據(jù)，為今后臨床開展精準(zhǔn)醫(yī)療提供指導(dǎo)依據(jù)。