干漆乙醇提取物通過調控HOXA-AS3/miR-29b分子軸抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲誘導凋亡*

董秋月,吳立春，劉妍喬，何進偉△

1.四川省樂山市市中區腫瘤醫院檢驗科，四川樂山 614000；2.四川省腫瘤醫院檢驗科，四川成都 610041

2020年全球女性乳腺癌新發病例2 260 000例，死亡病例680 000例，已超越肺癌成為全球第一大癌癥[1-2]。乳腺癌病例發現時多數已經是中晚期，且復發率高、五年生存期短，給患者及其家庭帶來巨大的經濟壓力和精神負擔[3-4]。因此，尋找高效、低毒的抗乳腺癌藥物是當前亟待解決的重大課題。

干漆是我國傳統中藥之一。近年研究顯示，干漆乙醇提取物可抑制乳腺癌實體腫瘤生長及其相關的肺轉移[5]，但其抗腫瘤機制目前尚未完全闡明。微小RNA(miR)-29b是一種抑癌基因，與肝癌、膽管癌、結直腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發生、發展密切相關[6-9]；同時miR-29b在乳腺癌中表達下調，高表達miR-29b能抑制乳腺癌增殖，誘導凋亡等生物學進程[10]。生物信息學分析顯示長鏈非編碼RNA(lncRNA)同源盒基因A反義轉錄3(HOXA-AS3)和miR-29b之間存在相互作用。HOXA-AS3高表達能促進肺癌[11]、膠質瘤[12]的進展，但干漆乙醇提取物能否調控HOXA-AS3/miR-29b分子軸進而影響乳腺癌細胞的生物學行為尚不清楚。本研究擬通過觀察不同水平的干漆乙醇提取物對乳腺癌細胞T47D增殖、遷移、侵襲、凋亡以及HOXA-AS3和miR-29b表達的影響，初步探討干漆乙醇提取物調控乳腺癌生物學行為的分子機制，為干漆乙醇提取物防治乳腺癌提供科學依據。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 人乳腺癌細胞T47D購于美國模式培養物集存庫；DMEM培養基和胎牛血清購于美國Gibco公司；干漆購于中藥材批發市場；細胞轉染試劑LipofectamineTM 2000、TRIzol試劑盒購于美國Ivitrogen公司；微小RNA(miRNA)抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、miR-29b抑制物(anti-miR-29b)、空載體(pcDNA)、HOXA-AS3過表達載體(pcDNA-HOXA-AS3)、HOXA-AS3小干擾RNA(si-HOXA-AS3)、HOXA-AS3小干擾RNA陰性對照(si-NC)由上海生工生物工程有限公司提供；miR cDNA第一鏈合成試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒購于大連Takara公司；Transwell小室和基質膠購于美國BD公司；CCK-8試劑盒、膜聯蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒購于杭州貝博生物技術公司；兔源P21、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購于美國CST公司；山羊抗兔二抗購于南京金斯瑞生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1干漆乙醇提取物的制備[13]將100 g干燥的干漆粉碎為粗粉，置于容器內，以料液比1∶3比例加入95%乙醇冷浸72 h，用紗布過濾，得濾液。重復冷浸提取3次，合并濾液，在40 ℃下減壓濃縮并收回乙醇至無醇味，冷凍干燥，得干漆乙醇提取物，-20 ℃保存備用。提取率為10.5%。

1.2.2細胞培養和分組 乳腺癌細胞T47D采用含有10%胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。采用不同水平(0、25、50、75 μg/mL)的干漆乙醇提取物處理T47D細胞48 h，檢測細胞增殖抑制率、克隆形成、遷移、侵襲、凋亡以及HOXA-AS3和miR-29b表達的變化，確定后續實驗干漆乙醇提取物使用水平。為驗證干漆乙醇提取物是通過調控HOXA-AS3/miR-29b分子軸進而影響乳腺癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲，利用LipofectamineTM 2000將pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS3、anti-miR-NC、anti-miR-29b分別轉染T47D細胞，轉染成功的T47D細胞用75 μg/mL的干漆乙醇提取物干預48 h，依次記為干漆75 μg/mL+pcDNA3.1組、干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3組、75 μg/mL+anti-miR-NC組、干漆75 μg/mL+anti-miR-29b組，檢測T47D細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡變化。

1.2.3CCK-8法檢測細胞活力 將1×104個T47D細胞鋪于96孔板，根據實驗分組進行相應細胞處理后，向各孔內加入10 μL的CCK-8試劑，繼續孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處各孔的吸光度值，計算細胞增殖抑制率。

1.2.4克隆形成實驗檢測細胞克隆能力 細胞按照上述分組進行干預后，用胰酶消化細胞，取2×103個細胞接種于6孔板，將細胞均勻分散后，置于細胞培養箱常規培養7 d，當看到肉眼可見的集落時，棄去培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞1次，分別加入多聚甲醛和結晶紫染液進行固定和染色，PBS沖洗3次，常溫晾干后，顯微鏡下統計>50個細胞的集落數。

1.2.5流式細胞術檢測凋亡 收集上述各組細胞，PBS洗滌細胞2次，離心后加入適量結合緩沖液調整為1×106cells/mL的單細胞懸液。取100 μL細胞懸液加入到流式管，按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒分別加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，避光孵育15 min，加入400 μL結合緩沖液混勻，采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

1.2.6Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力 侵襲實驗：在小室內鋪上用PBS 1∶8稀釋的Matrigel(50 mg/L)基質膠備用。收集上述各組細胞，采用不含血清的培養基調整細胞水平為3×106cells/mL。將Transwell小室放入24孔板，向上室內加入300 μL的細胞懸液，下室加入含20%血清的細胞培養液，培養箱孵育24 h，小心擦去未過膜細胞，4%的多聚甲醛固定10 min，0.1%的結晶紫染色5 min，PBS洗滌后，將Transwell小室倒置于顯微鏡下拍照，隨機選取3個視野拍照，記錄過膜細胞數，其平均值即為細胞侵襲數目。遷移實驗采用未包被基質膠的Transwell小室，其他步驟同上。

1.2.7qRT-PCR檢測HOXA-AS3和miR-29b的表達 TRIzol試劑盒提取各組的細胞總RNA，并分別應用miR cDNA第一鏈合成試劑盒和PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒合成cDNA模板，采用SYBR?Premix Ex TaqTM進行qRT-PCR檢測。分別以U6和GAPDH為內參照檢測miR-29b和HOXA-AS3的表達。應用2-ΔΔCt法計算miR-29b和靶標HOXA-AS3的表達量。引物由北京華大基因公司合成，序列如下。HOXA-AS3上游5′-GCTGAATTAACGGTGGCTCC-3′，HOXA-AS3下游5′-ATGGCGAGCGAAGGGAAG-3′；GAPDH上游5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3′，GAPDH下游5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′；miR-29b上游5′-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3′；miR-29b下游5′-CACUGAUUUCAAAUGGUGUUAUU-3′；U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游5′-AACGCTTCTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.8Western blot檢測P21、Caspase-3、E-cadherin和MMP-2蛋白的表達 各組細胞進行相應處理后棄去細胞培養液，加入4 ℃預冷的細胞裂解液，冰上裂解30 min后提取細胞總蛋白。BCA試劑盒測定細胞蛋白水平。煮沸3 min變性細胞蛋白。配制分離膠和濃縮膠，每孔上樣30 μg，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別加入稀釋的P21、Caspase-3、E-cadherin、MMP-2和GAPDH抗體后，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后，加入稀釋的二抗溶液，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后，用增強型化學發光試劑盒顯色。以GAPDH為內參，采用圖像處理軟件ImageJ分析目的條帶灰度值。

1.2.9雙熒光素酶報告基因實驗 采用Targetscan數據庫進行靶基因預測顯示，HOXA-AS3與miR-29b之間存在部分連續結合的核苷酸序列，并采用雙熒光酶報告基因實驗驗證miR-29b和HOXA-AS3的靶向關系。含有miR-29b結合位點的野生型熒光素酶報告基因載體WT-HOXA-AS3和突變型熒光素酶報告基因載體MUT-HOXA-AS3的構建由上海吉凱基因提供。將WT-HOXA-AS3、MUT-HOXA-AS3分別與miR-con、miR-29b mimics共轉染至T47D細胞，轉染48 h，檢測各組細胞的熒光素酶活性。為進一步驗證HOXA-AS3對miR-29b的調控關系，將pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS3、si-NC、si-HOXA-AS3分別轉染至T47D細胞，轉染48 h，采用qRT-PCR檢測miR-29b的表達。

2 結 果

2.1干漆乙醇提取物對細胞T47D增殖、凋亡的影響 與空白對照組比較，干漆乙醇提取物處理組T47D細胞P21和Caspase-3蛋白的表達顯著升高，細胞抑制率顯著升高，克隆形成數顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

注：A為干漆乙醇提取物對細胞T47D凋亡的影響；B為干漆乙醇提取物對細胞T47D中P21、Caspase-3蛋白表達的影響；a為0 μg/mL干漆乙醇提取物組，b為25 μg/mL干漆乙醇提取物組，c為50 μg/mL干漆乙醇提取物組，d為75 μg/mL干漆乙醇提取物組。

表1 干漆乙醇提取物對細胞T47D增殖、凋亡的影響

2.2干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲的影響 與空白對照組比較，干漆乙醇提取物處理組T47D細胞E-cadherin蛋白的表達顯著升高，MMP-2蛋白的表達顯著降低，遷移和侵襲細胞數目顯著減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。隨著干漆乙醇提取物水平的逐漸增加，其對T47D細胞遷移、侵襲的抑制作用逐漸增強。見圖2、表2。

注：A為干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲能力的影響；B為干漆乙醇提取物對細胞T47D中E-cadherin、MMP-2蛋白表達的影響；a為0 μg/mL干漆乙醇提取物組，b為25 μg/mL干漆乙醇提取物組，c為50 μg/mL干漆乙醇提取物組，d為75 μg/mL干漆乙醇提取物組。

表2 干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲的影響

2.3干漆乙醇提取物對細胞T47D中HOXA-AS3、miR-29b表達的影響 與空白對照組比較，干漆乙醇提取物處理組T47D細胞HOXA-AS3的表達顯著降低(P<0.05)，miR-29b的表達顯著升高(P<0.05)。隨著干漆乙醇提取物水平的逐漸升高，其對T47D細胞中HOXA-AS3和miR-29b表達的影響逐漸增強。見表3。

表3 干漆乙醇提取物對細胞T47D中HOXA-AS3、miR-29b表達的影響

2.4過表達HOXA-AS3能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D增殖、凋亡的影響 與干漆75 μg/mL+pcDNA3.1組比較，干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3組T47D細胞P21和Caspase-3蛋白的表達顯著降低，細胞抑制率顯著降低，克隆形成數顯著增多，細胞凋亡率顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 過表達HOXA-AS3能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D增殖、凋亡的影響

注：A為過表達HOXA-AS3能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D凋亡的影響；B為過表達HOXA-AS3能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D中P21、Caspase-3蛋白表達的影響；a為干漆75 μg/mL+pcDNA3.1組，b為干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3組。

2.5過表達HOXA-AS3能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲的影響 與干漆75 μg/mL+pcDNA3.1組比較，干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3組T47D細胞HOXA-AS3的表達顯著升高，E-cadherin蛋白的表達顯著降低，MMP-2蛋白的表達顯著升高，遷移和侵襲細胞數目顯著增多，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4、表5。

注：A為過表達HOXA-AS3能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲能力的影響；B為過表達HOXA-AS3能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D中E-cadherin、MMP-2蛋白表達的影響；a為干漆75 μg/mL+pcDNA3.1組，b為干漆75 μg/mL+pcDNA3.1-HOXA-AS3組。

表5 過表達HOXA-AS3能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲的影響

2.6抑制miR-29b能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D增殖、凋亡的影響 與干漆75 μg/mL+anti-miR-NC組比較，干漆75 μg/mL+anti-miR-29b組T47D細胞P21和Caspase-3蛋白的表達顯著降低，細胞抑制率顯著降低，克隆形成數顯著增多，細胞凋亡率顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5、表6。

表6 抑制miR-29b能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D增殖、凋亡的影響

注：A為抑制miR-29b能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D凋亡的影響；B為抑制miR-29b能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D中P21、Caspase-3蛋白表達的影響；a為干漆75 μg/mL+anti-miR-NC組，b為干漆75 μg/mL+anti-miR-29b組。

2.7抑制miR-29b能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲的影響 與干漆75 μg/mL+anti-miR-NC組比較，干漆75 μg/mL+anti-miR-29b組T47D細胞miR-29b的表達顯著降低，E-cadherin蛋白的表達顯著降低，MMP-2蛋白的表達顯著升高，遷移和侵襲細胞數目顯著增多，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖6、表7。

注：A為抑制miR-29b能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲能力的影響；B為抑制miR-29b能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D中E-cadherin、MMP-2蛋白表達的影響；a為干漆75 μg/mL+anti-miR-NC組，b為干漆75 μg/mL+anti-miR-29b組。

表7 抑制miR-29b能逆轉干漆乙醇提取物對細胞T47D遷移、侵襲的影響

2.8HOXA-AS3靶向調控miR-29b Starbase預測顯示HOXA-AS3與miR-29b之間存在本分連續結合位點，見圖7。雙熒光素酶報告實驗顯示，與miR-NC和WT-HOXA-AS3共轉染組比較，miR-29b和WT-HOXA-AS3共轉染組T47D細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-HOXA-AS3共轉染組比較，miR-29b和MUT-HOXA-AS3共轉染組T47D細胞的熒光素酶活性變化差異無統計學意義(P>0.05)，見表8。qRT-PCR檢測顯示，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-HOXA-AS3組T47D細胞miR-29b的表達顯著降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-HOXA-AS3組T47D細胞miR-29b的表達顯著升高(P<0.05)，見表9。提示HOXA-AS3靶向miR-29b并負性調控其表達。

圖7 HOXA-AS3靶向miR-29b

表8 雙熒光素酶報告實驗

表9 HOXA-AS3調控miR-29b的表達

3 討 論

近年來乳腺癌的發病率和病死率不斷升高并呈現年輕化趨勢，雖然治療手段及其方案不斷完善，但臨床治療效果并不顯著。研究顯示，中藥輔助治療在提高乳腺癌患者5年生存率和延長生存期方面發揮重要作用[14]。

干漆又名漆渣、漆底、漆腳、續命筒、黑漆，歷版《中國藥典》均有收錄，具有破瘀血、消積、殺蟲等功效，主要用于治療婦女經閉、瘀血、蟲積、肝臟疾病、胃病和傳染病等[15]。現代生物醫學研究表明，干漆乙醇提取物具有顯著的抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤和神經保護作用[16-18]。研究證實，干漆乙醇提取物可抑制人肺癌細胞A549以及人慢性粒細胞白血病K562細胞的生長并誘導凋亡作用[19-20]，抑制胰腺癌細胞的遷移和侵襲[21]；與此同時，干漆乙醇提取物還可通過腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和p53途徑分別調節乳腺癌細胞的存活和凋亡[22-23]。本研究結果顯示，干漆乙醇提取物呈劑量依賴性地抑制乳腺癌細胞T47D增殖，抑制MMP-2表達，促進P21、Caspase-3和E-cadherin表達，抑制其遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡，抑制乳腺癌細胞的惡性生物學行為。

miRNA廣泛參與腫瘤進展的多個生物學過程，近年來其被認為是中藥化合物抗腫瘤的潛在靶點[24]。miR-29b是miR-29家族成員之一，研究顯示乳腺癌等多種癌癥中miR-29b異常表達，與癌細胞增殖、分化、凋亡、轉移和藥物耐受相關[25]。本研究結果顯示，干漆乙醇提取物呈劑量依賴性地促進T47D細胞miR-29表達，抑制miR-29表達可逆轉干漆乙醇提取物對T47D細胞的凋亡誘導以及增殖、遷移、侵襲抑制的影響，提示miR-29b可能是干漆乙醇提取物抗乳腺癌的作用靶點。HOXA-AS3是一種新型的lncRNA，已有研究表明肝癌中HOXA-AS3表達上調，下調HOXA-AS3表達通過抑制絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節蛋白激酶(MEK/ERK)信號通路進而抑制肝癌細胞增殖、轉移和上皮間質轉化(EMT)進程[26]。下調HOXA-AS3表達還可增強順鉑對非小細胞肺癌的體內外療效[27]。本研究結果顯示，干漆乙醇提取物呈劑量依賴性地抑制T47D細胞HOXA-AS3表達；本研究還發現，過表達HOXA-AS3可逆轉干漆乙醇提取物對T47D細胞增殖、遷移、侵襲以及凋亡的影響。此外，雙熒光素酶報告基因實驗和Western blot證實，HOXA-AS3靶向miR-29b并負性調控miR-29b表達。因此，調控HOXA-AS3/miR-29b分子軸是干漆乙醇提取物調控乳腺癌細胞惡性生物學行為的重要機制。有研究報道，漆酚可能是干漆乙醇提取物的主要化學成分[28-29]，但漆酚是否是其發揮抗癌作用的主要成分還有待后續試驗進行深層次研究。