全基因組SNP-array聯合染色體核型分析在胎兒中樞神經系統異常產前診斷中的價值*

張 穎，金艷文，溫 艷，李偉偉

河北省承德市婦幼保健院：1.檢驗科；2.產科，河北承德 067000；3.河北省秦皇島市婦幼保健院遺傳優生科，河北秦皇島 066000

胎兒中樞神經系統(CNS)異常是最常見的胎兒先天畸形之一，其檢出率約為1%[1]。胎兒CNS異常的病因和機制尚不清楚。相關研究顯示，大約 40% 的致病因素可能是環境和遺傳因素[2]。胎兒CNS異常的臨床表現包括：輕度腦室擴大、后顱窩增寬、腦積水、胼胝體發育不全(ACC)和前腦無裂畸形等。隨著產前超聲的發展，大多數胎兒CNS異常均可經產前超聲檢查發現[3]。通常建議超聲異常的胎兒進行侵入性產前診斷，以確定其是否存在遺傳異常，確定可能的病因，并評估胎兒的預后。傳統的核型分析是診斷染色體異常的金標準，然而卻很難確定染色體微缺失和使用核型分析進行微重復，且需要長時間的細胞培養。染色體微陣列分析(CMA)因其提供的高分辨率而越來越多地被用于醫學領域的基因診斷，例如自閉癥、智力障礙、發育遲緩、流產或產前診斷。目前國外指南建議當超聲檢測到胎兒存在一個或多個結構異常時，用 CMA 代替傳統的核型分析[4-5]。CMA技術分為比較基因組雜交芯片和單核苷酸多態性微陣列芯片(SNP-array)兩種類型，均可以檢測染色體微缺失和微重復。SNP-array不僅可以檢測基因組拷貝數變異(CNV)，還可以檢測單親二倍體和嵌合體[6-7]。本研究應用全基因組SNP-array聯合染色體核型分析，探討二者聯合應用在胎兒CNS異常產前診斷中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018-2020年到河北省承德市婦幼保健院和秦皇島市婦幼保健院進行胎兒CNS異常產前診斷的患者275例。入組患者的孕周為13～39周，平均(26.21±7.84)周；年齡20～45歲，平均(32.44±7.83)歲；單純性CNS異常組163例，CNS異常合并其他異常組112例。單純性CNS異常指超聲異常僅局限于CNS；CNS異常合并其他異常意味著胎兒除CNS異常外，心臟、泌尿、消化和其他系統也存在異常。單純CNS異常163例，其中輕度腦室擴大62例，腦積水19例，后顱窩增寬10例，ACC 15例，蛛網膜囊腫16例，脈絡叢囊腫 15例，小頭畸形3例，室管膜下囊腫17例，小腦發育不全2例、脊柱畸形2例、沃二氏綜合征1例、腦膨出1例。所有入組患者均為單胎妊娠，本研究經醫院倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2染色體核型分析 根據兩個醫院建立的常規方法，對275例CNS異常胎兒的絨毛、羊水、臍帶血標本進行培養、收集、制備、G顯帶。采用GSL-120自動染色體掃描平臺(Applied Imaging公司)對制備的樣品進行采集分析。如疑為嵌合體或異常核型，則加倍計數，不少于 50 個分裂相。

1.3SNP基因分型芯片 使用Affymetrix公司的CytoScan 750k芯片和Illumina試劑盒按照標準操作程序進行基因組DNA擴增、雜交、掃描和數據分析。結果參考DGV(http://projects.tcag.ca/variation)、ISCA(https://www.iscaconsortium.org/)、OMIM(http://www.omim.org)、DECIPHER(htts://decinher.sanger.ac.uk/)等數據庫。根據相應標準將結果分為CNVs異常、臨床意義不明CNVs(VUS)和致病性CNVs。在CNVs異常的情況下，還對親代樣本進行檢測，以確定變異的遺傳性質及其臨床意義。

1.4統計學處理 采用SPSS25.0統計軟件進行數據分析。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1染色體核型分析結果 275例CNS異常胎兒中，有22例胎兒有致病性染色體異常，異常率為8.00%(22/275)，包括13-三體(3例)、18-三體(7例)、21-三體(5例)、其他染色體數目異常(1例)、染色體結構異常(6例)。單純性CNS 異常的染色體異常率為4.91%(8/163)，CNS異常合并其他異常的染色體異常率為 12.50%(14/112)，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1～2。

表1 胎兒CNS異常中的致病性染色體異常分析

2.2SNP-array分析 275例CNS異常胎兒采用SNP-array分析，除了染色體核型異常的22例胎兒之外(CNVs的結果與核型一致)，另檢測出23例CNVs異常胎兒，檢出率為8.36%(23/275)，其中致病性CNVs 15例，VUS 9例。163例單純性CNS異常胎兒中，CNVs異常10例，其中致病性CNVs 7例，VUS 3例。112例CNS異常合并其他異常胎兒中CNVs異常13例，其中致病性CNVs 8例，VUS 5例。單純性CNS異常組與CNS異常合并其他異常組致病性CNVs檢出率分別為4.29%(7/163)和7.14%(8/112)，差異無統計學意義(P>0.05)。CNS異常合并其他異常組的CNVs異常檢出率為11.61%(13/112)，高于單純性CNS異常組的6.13%(10/163)，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表3～6。

表2 單純性CNS異常組與CNS異常合并其他異常組中染色體異常情況(n)

表3 染色體異常胎兒SNP-array結果

表4 單純性CNS異常組與CNS異常合并其他異常組CNVs檢出情況[n(%)]

表5 CNS異常胎兒中致病性CNVs的SNP-array結果

表6 CNS異常胎兒中VUS的SNP-array結果

2.3染色體異常和致病性CNVs在單純性CNS異常組中的檢出率 單純性CNS異常組胎兒中染色體異常(8例)和致病性CNVs(7例)的檢出率為9.20%(15/163)。脈絡叢囊腫(16.00%)、室管膜下囊腫(17.67%)和脊柱畸形(50.00%)的染色體異常和致病性CNVs檢出率高于其他類型，但差異無統計學意義(P>0.05)。單純性CNS異常組胎兒中以輕度腦室擴大最多，占38.04%(62/163)，其中染色體異常和致病性CNVs占6.45%(4/62)，見表7。

表7 163例單純性CNS胎兒的表型特征

2.4臨床結局 在275例CNS異常胎兒中，245例成功隨訪，剩余病例未能隨訪成功的原因包括患者拒絕隨訪、失聯等。除染色體異常(22例)、致病性CNVs(15例)和VUS(8例)的胎兒被終止妊娠，另外有28例胎兒其核型分析和SNP-array結果顯示正常，但仍然終止妊娠。

3 討 論

遺傳是導致胎兒發生CNS異常最主要的因素[8]，CNS異常可導致胎兒腦脊液紊亂、左心室變形或者擴張，并且有極大概率導致胎兒多個腦室的異常改變[5]。胎兒CNS異常多數預后不良，且致殘性高。目前通過產前超聲篩查、遺傳分析和臨床咨詢，可以評估CNS異常胎兒的預后[9]。嚴重畸形和染色體異常的胎兒可以及時終止妊娠，有效控制嚴重畸形胎兒的出生率，對指導優生優育、減少出生缺陷、提高新生兒人口素質具有重要的臨床意義。本研究對伴或不伴其他超聲異常的CNS異常胎兒進行染色體核型分析和SNP-array聯合檢測。染色體核型分析檢出22例異常核型，染色體異常檢出率為8.00%，這說明非整倍體和大片段染色體的異常會引起遺傳的改變，擾亂基因間的平衡，從而導致胎兒多系統畸形。除了22例染色體核型異常(CNVs的結果與核型一致)，SNP-array另檢測到23例異常CNVs，其檢出率為16.36%(45/275)。本次研究中的23例異常CNV片段的缺失或者微重復大小不同，傳統的核型分析無法識別。研究表明，胎兒CNS異常的病因除了與染色體異常有關外，還與染色體微缺失和/或微重復有關[10]。SNP-array的使用可以彌補傳統核型分析的不足，對于核型分析正常的胎兒出現CNS異常，應建議采用SNP-array進行進一步檢測。染色體核型分析需要進行細胞培養，耗時長，另外需要具有經驗的分析人員對染色后的標本進行計數，檢測的周期較長，而且由于培養失敗等問題易導致無法檢測。SNP-array是一種基因芯片技術，屬于CMA，與傳統的核型技術相比具有更高的分辨率，可識別Kb水平的微缺失和微重復。SNP-array技術可額外發現6%～15%的染色體結構異常[11]。由于SNP-array技術不需要進行細胞培養，在臨床的應用越來越廣泛，尤其對于一些傳統產前診斷染色體核型分析無法檢測到的亞微結構CNVs的診斷很有價值[12]。

CNS異常合并其他異常組的CNVs異常檢出率高于單純性CNS異常組(11.61%和6.13%)，但差異無統計學意義(P>0.05)。因此，對于有CNS異常表現的胎兒，特別是有多種CNS異常表現的胎兒，建議使用染色體核型和SNP陣列聯合檢測進行最終診斷。單純性CNS異常組的染色體異常和致病性CNVs的檢出率為9.20%。脈絡叢囊腫、室管膜下囊腫和脊柱畸形的染色體異常和致病性CNVs檢出率高于其他單純性CNS異常胎兒。既往研究也表明，在通過CMA檢測致病性CNVs的情況下，單純性CNS異常胎兒的額外檢出率為6.5%～8.3%，而這是傳統的核型分析所不能檢測的[13-14]。SNP-array檢測技術發現的23例CNVs異常患者中，15例為致病性CNVs，其中有7例是大眾熟知的微缺失/微重復綜合征，5例16p11.2和2例22q11.2微缺失綜合征。本研究中經SNP-array發現的5例16p11.2微缺失綜合征有著不同的超聲異常表現，輕度腦室擴大1例，腦積水、脊柱畸形、腦膨出各1例，其余1例除輕度腦室擴大外還有其他的超聲異常。16p11.2微缺失綜合征的發病率約為0.3%[15]，主要臨床癥狀包括智力障礙和自閉癥譜系障礙。T-box轉錄因子6是導致16p11.2微缺失綜合征患者椎體畸形的關鍵基因[1]。目前，關于16p11.2微缺失綜合征胎兒的報道很少，只有少數研究報道了與16p11.2微缺失綜合征相關的超聲異常，包括心臟畸形、多囊腎、鼻骨缺失、單臍動脈、宮內發育遲緩等[16]。本研究經SNP-array 發現的2例22q11.2微缺失綜合征均為脈絡叢囊腫，只是其中1例除此之外表現了其他的超聲異常。22q11.2微缺失綜合征的發病率約為1/4 000,臨床癥狀表現不一。本研究經SNP-array 還檢測到1例17號染色體的p13.3p13.2 5.2M的缺失，這個缺失可導致Miller-Dieker綜合征即無腦回畸形綜合征，其發病率為1.2/100 000，通常的臨床特征為ACC、小頭畸形等。本研究中該病例的超聲顯示輕度腦室擴大、小腦發育不全和其他超聲異常。

雖然SNP-array技術能夠提高CNS異常胎兒的致病性遺傳性變異的檢出率，但是這種檢測技術即CMA有其自身的不足，例如檢測出的VUS病例使遺傳咨詢變得困難。根據文獻報道[17]，CMA對VUS的檢出率為1.1%～6.0%。本研究中的275例CNS異常病例中，共有8例 VUS病例，包括單純性CNS異常以及CNS異常合并其他異常，VUS在CNS異常中的檢出率為2.91%，與以往報道檢出率呈一致性。本研究中檢測到的VUS病例中，有4例含有神經發育相關的易感基因，包括1例15q13.3重復、1例16p13.11重復、1例1q21.1q21.1重復、1例1q21.1缺失。神經發育的易感位點外顯不全，可能表現為心血管疾病、認知障礙、行為障礙和智力障礙等[18]。神經發育的易感位點外顯率不完全使產前遺傳咨詢面臨極大挑戰。而3p22.1缺失則僅包含1～3個OMIM基因，這些變異與神經系統發育無關，但超過了報告閾值。而18q11.2重復則包含了PIGN基因的16-31外顯子，純合突變導致多發性先天性abnormalities-hypokalemia-epilepsy綜合征，臨床表現為運動發育障礙、癲癇、多種畸形和各種先天性異常包括心臟、泌尿系統和胃腸系統[19-20]。因此近年來，下一代測序重點研究單基因突變檢測[21]，以為更好地評估胎兒預后提供更全面的方法。

本研究將核型分析與SNP-array相結合，可以幫助CNS異常胎兒的父母做出是否終止妊娠的決定。例如，在輕度腦室擴大的胎兒中，來自SNP-array陣列的正常結果表明胎兒可能有更好的預后，父母可以選擇繼續妊娠。在本研究成功隨訪的245例患有CNS異常的胎兒中，除外染色體異常和致病性CNVs的胎兒之外，另有28例患兒其核型和SNP-array結果顯示正常，但仍然終止妊娠。所以即使核型和SNP-array結果正常，大多數胎兒CNS異常和多種畸形的父母仍然決定終止妊娠，因為他們認為這些異常的畸形或者疾病在產后得不到較好的治療，出生后胎兒會具有嚴重的臨床表現，如嚴重畸形、智力障礙等。與傳統的核型分析相比，單核苷酸多態性陣列可以在CNS異常的胎兒中發現更多的CNVs異常[22]。

綜上所述，染色體核型分析為是否存在染色體數目和結構變異提供重要的實驗依據，但其最大的不足在于細胞培養失敗與母體細胞污染等問題出現的概率較高，再加上無法檢測染色體的微缺失/微重復，需要聯合SNP-array檢測進一步確定。SNP-array檢測結果包括拷貝數變異、微缺失/微重復、染色體非整倍體數目異常、三倍體、單親二倍體、雜合性丟失、嵌合體等，可以獲得更精準的遺傳信息，利于產前咨詢，但是其劣勢則是該檢測方法價格昂貴，提高了臨床推廣的難度，希望后期可以降低價格以發揮其更大的優勢。盡管如此，仍建議將SNP-array用于CNS異常胎兒的產前診斷，可以更好地進行產前評估和遺傳咨詢，并發揮聯合檢測的優勢。