腫瘤壞死因子-β基因多態性與大動脈粥樣硬化型腦梗死的相關性*

劉利寧，李毓新，王曉芳

西安醫學院第二附屬醫院神經內科，陜西西安 710038

腦梗死是臨床常見病，其發病率高、致殘率高、病死率高，一直為研究熱點。在該病的病理生理過程中，動脈粥樣硬化斑塊的形成和進展發揮著至關重要的作用[1]。近年來,國外一些研究發現，腫瘤壞死因子-β(TNF-β)A252G、C804A基因多態性可影響TNF-β的表達水平，進而與動脈粥樣硬化性疾病相關[2-3]。本研究應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)分析技術和聚合酶鏈反應-序列特異性引物法(PCR-SSP)對本地區部分大動脈粥樣硬化型(LAA)腦梗死患者及健康對照者的TNF-β A252G、C804A位點基因進行檢測分型，旨在探索該基因多態性與LAA腦梗死發病的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2016年9-12月收治的80例LAA腦梗死住院患者為腦梗死組。患者全部符合《各類腦血管疾病診斷要點》中腦梗死的診斷標準，全部病例均經臨床、頭部CT及頭部MRI掃描證實，且行腦血管評估(頸動脈B超+頭磁共振血管造影、頭+頸部CT血管造影或腦數字剪影血管造影)證實TOAST分型為LAA，并排除腦梗死出血性轉化以及合并多臟器功能不全、風濕免疫性疾病、感染性疾病。其中男42例，女38例；年齡40～75歲，平均(61.2±7.9)歲；體質量指數20.0～26.3 kg/m2，平均(22.9±2.9)kg/m2；病程≤1周，神經功能缺損評分(NIHSS評分)：4～15分。對照組80例，為本院同一時期在門診體檢的健康人群，無腦梗死、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病病史，經頸動脈B超證實無頸動脈粥樣硬化，并排除風濕免疫性疾病以及近2周內發生過炎性病變。其中男40例，女40例；年齡45～72歲，平均(58.0±8.7)歲；體質量指數20.1～26.0 kg/m2，平均(22.5±2.4)kg/m2。兩組患者的年齡、性別、體質量指數等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1臨床資料 通過問診和體格檢查收集研究對象的臨床資料，包括有無高血壓、糖尿病病史，有無吸煙、飲酒史，并抽血檢測以下生化指標：空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血同型半胱氨酸(Hcy)。

1.2.2DNA提取 取臨床采集的外周血樣本1.0 mL，以枸櫞酸抗凝，用血液基因組DNA分離試劑盒(TIANGEN公司)分離白細胞的基因組DNA，操作按試劑盒說明進行。

1.2.3引物設計與合成 應用Primer 5軟件，參照文獻[4]設計TNF-β A252G基因引物，P1：5′-AGA GCT GGT GGG GAC ATG TCT G-3′；P2：5′-CCG TGC TTC GTG CTT TGG ACT A-3′。P1、P2擴增第1內含子至第3外顯子的一段基因，長度為740 bp。參照文獻[5]設計TNF-β C804A基因引物，F1：5′-ACC ACC TGA ACG TCT CTT CCT-3′；R1：5′- GTG AGC AGC AGG TTT GAG GTA-3′，用于檢測A位點；F2：5′-GCA TCT TGC CCA CAG CAC-3′；R2：5′-GGC ACT GAA CAA CTG AGT TCC-3′，用于檢測C位點。

1.2.4PCR反應體系 (1)A252G位點基因分型檢測采用PCR-RFLP方法：擴增體系為25 μL，含100 ng模板DNA，10 pmol引物P1、P2，2×Taq Platinum PCR Master Mix(TIANGEN公司)，去離子水。擴增條件：95 ℃預變性6 min，按以下條件循環30次，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。末次循環后，72 ℃再延伸7 min。取10 μL PCR擴增產物，加入10 U NcoⅠ(Takara公司)，于37 ℃孵育2 h。(2)C804A位點基因分型檢測采用PCR-SSP方法：擴增體系為25 μL，含100 ng模板DNA，10 pmol引物F1、R1，F2、R2，2×Taq Platinum PCR MasterMix(TIANGEN公司)，去離子水。擴增條件：95 ℃預變性10 min，按以下條件循環30次，95 ℃變性1 min，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min。末次循環后，72 ℃再延伸5 min。

1.2.5PCR-RFLP產物分析 酶切產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳結果經凝膠成像系統拍照，分析判讀。

1.2.6PCR-SSP產物分析 PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳結果經凝膠成像系統拍照，分析判讀。

2 結 果

2.1兩組臨床資料比較 腦梗死組中合并高血壓、糖尿病、吸煙史患者所占比例顯著高于對照組(χ2=30.83、10.46、8.03，P<0.05)；腦梗死組中FBG水平顯著高于對照組(t=-3.21,P<0.05)；兩組中有飲酒史者所占比例、TC、TG、LDL-C、Hcy水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2基因型的確定

2.2.1TNF-β A252G基因型確定 GG型，擴增的基因片段含有NcoⅠ酶切位點，可被完全酶切為555、185 bp；GA型，產生不完全酶切，出現740、555、185 bp共3條帶；AA型，不產生酶切，電泳后只出現740 bp條帶。見圖1。

注：M為DNA分子量標準。
圖1 TNF-β A252G基因酶切產物瓊脂糖凝膠電泳結果

2.2.2TNF-β C804A基因型確定 CC型為218 bp，CA型為218、279 bp，AA型為279 bp。見圖2。

注：M為DNA分子量標準。
圖2 TNF-β C804A基因PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果

2.3基因型頻率、等位基因頻率分析 腦梗死組TNF-β A252G中GG的基因型頻率高于對照組(P<0.05)；AA基因型頻率低于對照組(P<0.05)；G的等位基因頻率在腦梗死組中高于對照組(P<0.05)；A的等位基因頻率低于對照組(P<0.05)。見表2。TNF-β C804A中AA基因型頻率在腦梗死組中高于對照組(P<0.05)；A的等位基因頻率高于對照組(P<0.05)；CC基因型頻率、C的等位基因頻率低于對照組(P<0.05)。見表3。

表2 TNF-β A252G基因多態性比較[n(%)]

表3 TNF-β C804A基因多態性比較[n(%)]

2.4影響LAA腦梗死發生的多因素分析 將腦梗死作為因變量，高血壓、糖尿病、吸煙史、FBG水平、TNF-β A252G基因型分布、TNF-β C804A基因型分布為自變量，進行Logistic回歸分析。結果顯示，高血壓、糖尿病、吸煙史、FBG水平、TNF-β A252G基因型為GG型、TNF-β A252G等位基因為G型、TNF-β C804A基因型為AA型、TNF-β C804A等位基因為A型是LAA腦梗死發生的危險因素。見表4。

表4 影響LAA腦梗死發生的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

TNF-β是淋巴細胞在抗原或有絲分裂原刺激下分泌的一種重要的促炎細胞因子。SCHREYER等[6]應用免疫組化染色技術發現TNF-β在動脈粥樣硬化斑塊內廣泛表達；與此同時，他們還發現與野生鼠相比，TNF-β基因敲除小鼠形成的動脈粥樣硬化損傷體積減少為原來的62%[6]。QIAN等[7]研究顯示，給予ApoE基因敲除小鼠短時間注射重組人TNF-β拮抗劑可以抑制動脈粥樣硬化病變。這些研究均提示TNF-β作為一種致炎因子，在動脈粥樣硬化斑塊的發生、發展中，起著重要的作用。其主要途徑為通過激活NF-κB信號通路促進血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、E選擇素(E-selectin)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等高表達，使得白細胞黏附到血管內皮細胞，并向血管內膜下間隙遷移，釋放大量活性氧和彈性蛋白酶，繼而損傷血管壁[7-8]。

TNF-β基因位于染色體6p21(MHCⅢ類基因區)內，由4個外顯子和3個內含子組成。A252G基因位于TNF-β基因第1內含子+252位點，當堿基為G時,產生了NcoⅠ的識別位點,能被NcoⅠ限制性內切酶識別切斷，該基因稱為TNF-β*1，當堿基為A時，改變了NcoⅠ位點，該基因稱為TNF-β*2。C804A基因位于TNF-β基因第3外顯子+804位點，該位點存在1個C到A突變的單核苷酸多態性，可導致密碼子26編碼的氨基酸由蘇氨酸變為天冬氨酸。MESSER等[9]認為A252G能導致TNF-β表達水平升高，TANAKA等[10]亦發現252A/G突變后可使TNF-β的轉錄活性提高1.5倍，且他還證實了804C/A突變后血管平滑肌細胞產生VCAM-1、E-selectin的能力可提高2倍。故本研究選取LAA腦梗死患者為主要研究對象，進行TNF-β A252G、C804A基因多態性分析，探討它們之間的相關性。

已有國內外學者對TNF-β A252G、C804A基因多態性與腦梗死的相關性進行研究，但結論尚不統一。ZHAO等[11]在漢族中選取了1 124例腦梗死患者和1 163例健康對照者檢測分析TNF-β A252G基因多態性分布，結果發現A252G基因頻率增高是無高血壓缺血性腦卒中的風險因子。UM等[12]在對294例腦梗死患者和581例健康對照者進行的TNF-β A252G基因多態性分析中卻發現腦梗死患者AA基因型頻率較健康者增高(χ2=6.991，P=0.03)，可能的機制為該基因型導致了TNF-α、白細胞介素(IL)-6等經典炎癥因子的高表達[13]。與上述結果不同，FASIHI等[14]在伊朗東北部地區進行了類似研究，選取了186例LAA腦梗死患者，結果未能發現TNF-β A252G與腦梗死的相關性。除此之外，為探究TNF-β C804A與腦梗死是否具有相關性，TROMPET等[15]對5 389例合并多種心腦血管疾病危險因素的人群進行跟蹤隨訪研究，結果顯示，攜帶TNF-β C804A基因可能增加男性腦梗死的發生率，且基因型AA與基因型CA相比發生腦梗死風險更高(HR：2.07vs.1.43)。近年來還有部分研究對腦梗死患者同時進行TNF-β A252G、C804A基因多態性的分析。KUMAR等[5]在印度北部地區收集了250例腦梗死患者的外周血液標本，分析TNF-β A252G、C804A的基因多態性，最終得出結論：TNF-β A252G、C804A基因多態性與總卒中風險無相關性，但A252G基因多態性與小動脈閉塞型腦梗死具有相關性。而SZOLNOKI等[16]研究則顯示TNF-β A252G與C804A為共存關系，同時承載A252G、C804A的單體型為大動脈粥樣硬化型CI的遺傳易感因素，但與小動脈閉塞型腦梗死無明顯相關性。盡管如此，HAGIWARA等[17]抽取日本地區1 044例腦梗死患者和1 044例健康對照者進行TNF-β A252G、C804A基因多態性分析，卻發現兩者缺乏相關性。

本研究結果顯示，腦梗死組TNF-β A252G、C804A基因型分布與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，其中TNF-β A252G的GG、TNF-β C804A的AA基因型頻率明顯高于對照組(P<0.05)。除此之外，本研究還比較了TNF-β A252G、C804A等位基因頻率，發現腦梗死組TNF-β A252G的G、TNF-β A804A的A等位基因頻率亦顯著高于對照組(P<0.05)。由于在臨床資料比較中，腦梗死組合并高血壓、糖尿病、吸煙史的患者所占比例及FBG水平明顯高于對照組(P<0.05)，而這些因素為腦血管病傳統危險因素，需進一步采用Logistic回歸分析，規避上述因素對研究結果的干擾，結果仍提示TNF-β A252G基因型為GG型、等位基因為G型、TNF-β C804A基因型為AA型、等位基因為A型是LAA腦梗死發生的獨立危險因素(OR=2.29、1.79、2.23、1.74)。上述結果說明TNF-β A252G的GG、TNF-β C804A的AA基因型可能是LAA腦梗死的易感基因，攜帶此基因型會增加LAA腦梗死的易感性，可能的機制為這些基因型或等位基因導致了TNF-β的高表達，進而促進動脈粥樣硬化的形成和發展。除此之外，這兩個基因座位具有連鎖不平衡性(LD)，當第一個內含子252位為G時，常常伴隨著第3外顯子區域內804位點處突變為A，導致密碼子26編碼的氨基酸由蘇氨酸變為天冬氨酸，而當一個內含子252位為A時，第3外顯子區域內804位點處常替換為C，導致密碼子26編碼的氨基酸為蘇氨酸[9,16]。

綜上所述，TNF-β A252G、C804A基因多態性與LAA腦梗死發生有關，TNF-β A252G基因型為GG型、等位基因為G型，TNF-β C804A基因型為AA型、等位基因為A型可能是LAA腦梗死的易感基因，有望成為腦梗死高危人群篩選的標志物及干預靶點，但仍需擴大樣本量、檢測基因表達產物進行更為精細化驗證。