不規則抗體陽性患者外周血Tfh、Tfr細胞亞群檢測及臨床意義

黃國清 張勇剛 伍昌林 王強 王素云 周仁龍 楊東莞 彭銀艷

輸血依賴性地中海貧血患者需長期依賴輸血維持生命，定期輸血患者易產生血型不規則抗體。近年定期輸血患者同種免疫機制與防治策略是全球研究的熱點與難點，目前國內外研究表明Th1、Th2、Th17 及Treg 細胞失衡與同種免疫相關，但近年研究的新型Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 細胞亞群免疫平衡在血型同種免疫中的作用尚不完全明確[1～3]。本項目將研究血型同種免疫產生的不規則抗體陽性患者外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 細胞亞群比例及ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 水平，分析Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值變化及其臨床意義，探討Tfh、Tfr 細胞亞群及相關因子在血型同種異體免疫機制中的作用，為定期輸血患者血型不規則抗體的預防提供實驗依據與治療思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2019年1月～2021年7月在我院定期輸血的不規則抗體篩查陽性患者32 例，其中男15 例，女17 例，年齡14～58 歲，平均32.5 歲。排除合并自身抗體或其它自身免疫病的患者。隨機選擇定期輸血的32 例不規則抗體篩查陰性患者作為對照組，其中男18 例，女14 例，年齡13～56 歲，平均34 歲。本研究符合我院倫理標準，獲倫理委員會的批準，參與者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 不規則抗體篩選細胞（上海生物醫藥），不規則抗體鑒定譜細胞（荷蘭三昆公司），細胞檢測的熒光標記抗體：抗人-CXCR5單克隆抗體，抗人-CD4 單克隆抗體、抗人-FoxP3 單克隆抗體、抗人-CXCR3 和CCR6 單克隆抗體；同型對照的熒光抗體IgG1 單克隆抗體（美國BD 公司）。酶標儀（匯松MB-580）和流式細胞儀（美國BD 公司），細胞因子ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 ELISA 試劑盒（美國RD 公司），KA-2200 型離心機（日本久保田），卡式離心機（西班牙戴安娜公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 兩組外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 細胞亞群的檢測 抽取EDTA 抗凝的不規則抗體陽性患者外周血3ml，利用Ficoll 淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞（PBMC），分離細胞濃度為1×106的PBMC 懸液100μl；分別加入熒光標記抗體：一組加入CD4、CXCR5、FoxP3 抗體；另一組加入CD4、CXCR5、CXCR3 和CCR6 抗體，4℃避光孵育30min，1 800r/min 離 心6min 棄上清，加入PBS 2ml 吹打均勻，再次1 800r/min 離心6min 棄上清；然后上流式細胞儀檢測上述細胞。外周血Tfh 及其亞型定義如下：Tfh：CD4+CXCR5+T 細胞；Tfh1：CXCR3+CCR6-Tfh 細胞；Tfh2：CXCR3-CCR6-Tfh 細胞；Tfh17：CXCR3-CCR6+Tfh 細 胞；Tfr：CD4+CX CR5+FoxP3+T 細胞。分析比較Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr細胞亞群的比值變化。

1.3.2 兩組外周血ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 細胞因子檢測 取前期凍存血清，溶解后每個樣本和標準品均設3 孔檢測，酶標儀在520nm 波長處讀取OD 值并取均值，由標準品在配套軟件上自動繪制標準曲線，將各樣本的OD 值在標準曲線上找到對應值，獲得待測樣本ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10含量，并比較ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值差異。以上操作均按ELISA 試劑盒說明書進行。

1.3.3不規則抗體陽性患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值與血型不規則抗體效價變化的相關分析 采用倍比稀釋法檢測血型不規則抗體的效價水平（IgG、IgM 或IgG+IgM），同時比較分析不規則抗體陽性患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值變化，Spearman 相關分析法評價其與不規則抗體總效價變化的相關性。

1.4 統計學分析 本研究所有實驗結果均采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析。兩組間差異采用兩樣本t檢驗，兩變量間的相關性用Spearman 相關分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 細胞亞群與Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 比值比較 與對照組比較，實驗組CD4+T 細胞中CXCR3-CCR6-Tfh（Tfh2）細胞的比例升高，而CD4+CXCR5+FoxP3+T 細胞（Tfr）比例降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。Tfh1/Tfh2 細胞亞群比值降低，Tfh17/Tfr 細胞亞群比值升高，兩組CXCR3+CCR6-Tfh 細 胞（Tfh1）與CXCR3-CCR6+Tfh細胞（Tfh17）比例無顯著性差異（P＞0.05），見表1。

2.2 兩組外周血Tfh/Tfr 細胞亞群的效應細胞因子ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 及ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比較 與對照組比較，實驗組血清中IL-4水平明顯高于對照組，IL-10 的表達水平低于對照組，IL-17/IL-10 比值高于對照組，ILN-γ/IL-4 比值低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組細胞因子ILN-γ、IL-17 水平比較無顯著性差異（P＞0.05），見表2。

表1 兩組外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 細胞與Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 比值（±s）

表1 兩組外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17、Tfr 細胞與Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 比值（±s）

組別 例數 Tfh1（%） Tfh2（%） Tfh17（%） Tfr（%） Tfh1/Tfh2 Tfh17/Tfr實驗組 32 22.63±5.61 3.80±0.69 22.46±3.27 2.56±2.32 5.35±1.21 8.35±2.23對照組 32 24.41±4.35 1.53±0.38 20.98±4.25 4.20±1.34 15.64±3.35 4.94±1.38 t 1.42 16.3 1.24 3.49 16.6 7.53 P＞0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表2 外周血ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 及ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比較（±s）

表2 外周血ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 及ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比較（±s）

組別 例數 ILN-γ（pg/ml） IL-4（pg/ml） IL-17（pg/ml） IL-10（pg/ml） ILN-γ/IL-4 IL-17/IL-10實驗組 32 80.56±15.22 26.35±6.83 71.31±12.81 21.35±5.58 3.05±1.72 3.55±0.72對照組 32 77.31±10.23 15.37±5.65 75.37±13.64 45.55±8.66 5.13±1.85 1.66±0.82 t 1.01 7.26 1.28 13.3 4.75 9.52 P＞0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.3 不規則抗體陽性患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值與不規則抗體效價的相關性分析 不規則抗體效價范圍為1：2 至1：256，經Spearman 相關性分析表明Tfh17/Tfr、IL-17/IL-10比值變化與不規則抗體效價呈正相關（r=0.59、0.75，P均＜0.05），見圖1A、1B；外周血Tfh1/Tfh2、ILN-γ/IL-4比值變化與不規則抗體效價呈負相關（r=-0.48、-0.77，P均＜0.05），見圖1C、1D。

圖1 Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比值與不規則抗體效價的相關性

3 討論

輸血依賴性地中海貧血患者需長期依賴輸注異體紅細胞懸液，因此易產生紅細胞血型抗原同種免疫。但是血型同種免疫的發生機制目前尚不明確，如何有效預防同種異體血型不規則抗體的產生，減少輸血反應，提高臨床輸血療效，是臨床輸血研究的熱點。目前國內外科研人員對輸血同種免疫患者的細胞免疫平衡進行了大量研究，發現Th1、Th2、Th17 與Treg 等免疫細胞平衡在血型同種免疫機制中發揮重要作用[4，5]，但是Tfh 細胞亞群（Tfh1、Tfh2、Tfh17）與Tfr 細胞在血型同種免疫機制中的作用尚不完全清楚且報道較少。

CD4+CXCR5+Tfh 細胞是CD4+效應性T 細胞，其可輔助B 細胞產生抗體并通過IL-10、IL-21 等效應因子發揮作用。Tfh 細胞亞群與Tfr 細胞的免疫失調在自身免疫性疾病發生機制中的作用近年已被證實[6]，但其在血型同種免疫中的研究報道較少。外周血Tfh 細胞可根據表面趨化因子CXCR3 和CCR6不同分為3 種不同功能亞群：Tfh1、Tfh2、Tfh17；此外Tfr 兼有Tfh 及Treg 細胞雙重性質。這些細胞亞群與自身免疫病患者自身抗體的產生密切相關[7]。Tfh1、Tfh2、Tfh17 及Tfr 與傳統的Th1、Th2、Th17及Treg 細胞亞群相似，可分泌ILN-γ、IL-4、IL-17、IL-10 等不同的效應細胞因子，但Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 細胞平衡在血型同種免疫中的作用機制尚不十分明確。本研究發現輸血過程中部分患者易發生血型同種免疫，可能由于Tfh 細胞亞群輔助B 細胞產生高親和力同種抗體，Tfr 細胞則可抑制血型同種抗體產生，但影響血型同種抗體產生的Tfh亞群類型不明確。有研究發現Th17/Th22/Treg 平衡失調參與自身免疫病患者自身抗體產生[8]，但尚不完全明確血型不規則抗體陽性患者外周血Tfh1、Tfh2、Tfh17 與Tfr 平衡偏移及其血型同種抗體效價之間的關系。

本研究對血型不規則抗體陽性患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 細胞平衡狀況進行探索，發現與對照組相比，實驗組患者CD4+T 細胞中Tfh2 細胞比例升高，而Tfr 比例降低，Tfh1 與Tfh17 比例無顯著性差異，而Tfh1/Tfh2 細胞亞群比值降低，Tfh17/Tfr 細胞亞群比值升高，差異有統計學意義（P＜0.05），Tfh17/Tfr 與患者血型不規則抗體的效價呈正相關，Tfh1/Tfh2 比值與患者血型不規則抗體效價呈負相關。結果提示Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 細胞失調可能參與血型同種免疫機制，免疫抑制細胞數量或功能下降可能是血型同種免疫易感性的重要原因之一[9，10]。同時Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr 細胞效應分子水平也可能與血型不規則抗體的發生率相關，實驗組患者外周血血清中IL-4 水平明顯高于對照組，IL-10 的表達水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；細胞因子ILN-γ、IL-17 與對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。實驗組IL-17/IL-10 比值高于對照組，ILN-γ/IL-4 比值低于對照組，且IL-17/IL-10 比值與血型不規則抗體效價呈正相關，ILN-γ/IL-4 比值變化與血型不規則抗體效價呈負相關。表明血型同種免疫患者Tfh1/Tfh2 細胞變化與Tfh17/Tfr 的調節效應相反，這與當前研究結果相近[11～13]，Tfh2 亞群可能促進血型同種免疫產生，激活機體免疫效應功能[14]。

本研究分析表明Tfh2 細胞亞群是血型不規則抗體產生的重要效應細胞，而Tfr 細胞具有負性調節功能，可抵制或減弱血型同種異體免疫的產生；由于血型抗原同種免疫患者外周血Tfh1/Tfh2、Tfh17/Tfr、ILN-γ/IL-4、IL-17/IL-10 比例失調，可能是導致定期異體輸血患者血型抗原同種免疫發生的重要原因，但具體信號調控機制有待深入研究[15]，因此我們可將Tfh2、Tfr 細胞亞群平衡及其效應因子IL-4、IL-10 作為預防血型抗原同種免疫的新靶標，可通過免疫調節糾正定期輸血患者Tfh/Tfr 細胞亞群比例失衡，對預防并減少血型不規則抗體的發生具有重要意義。