水驅油藏微生物群落結構及影響因素

劉音頌， 韋海文， 王繼剛， 李博， 楊二龍*

(1.東北石油大學石油工程學院, 大慶 163318; 2. 東北石油大學三亞海洋油氣研究院, 三亞 572000; 3.廣東石油化工大學機電工程學院, 茂名 525000)

目前，中國主力油田多已進入開采中后期，由于長期開發，采出液含水率高，面臨儲采失衡、產量逐年遞減等矛盾。即便實施三次采油仍有30%～40%的原油地質儲量滯留在地下，其開采難度進一步增大，因此如何經濟有效地開采這部分剩余油，對老油田可持續發展非常重要。

微生物采油技術是通過利用微生物生長、繁殖及其代謝產物(包括生物表面活性劑、生物聚合物、生物酸、酶、溶劑和生物酶)來調動殘余油[1]。微生物驅油分為外源微生物驅油和內源微生物驅油[2]。外源微生物采油主要通過室內篩選出自然采油菌或采用基因工程學方法培育出工程采用菌，經地面培養后注入油藏[3]，而內源微生物驅油技術則是通過注入適宜的營養激活劑以激活油井中的功能微生物，通過內源微生物自身的代謝活動來提高原油采收率。相對而言，內源微生物采油技術具有更能適應油藏環境、不需要菌種保藏和菌液生產、操作成本低等特點，在油田中具有更廣闊的應用前景[2，5]。目前現場試驗中，孤島油田向一區館3區塊累計注入營養體系405 t，實現累計增油量1×104t[5]；勝利油田辛68區塊通過注入營養激活劑實現日產油量提高0.8 t[6]，沾3區塊日產油量由激活前的2.5 t/d上升至14.0 t/d[7]；大慶油田第四采油廠A區塊在注入營養激活劑后平均日產液量由456 t增加倒528 t，平均日常油量由15.2 t增加到28.5 t[8]，驅油效率得到顯著提高。盡管激活劑的注入能夠刺激地層微生物的快速生長繁殖，從而改善原油驅替效果，但激活劑篩選周期長，對不同區塊的油藏都需要進行重新篩選激活劑，主要原因是對地層中的群落結構認識不足，難以實現有針對性激活油藏微生物。

傳統人工培養方法難以完整反映群落生態系統，多種分子生物學技術逐漸被廣泛應用于物種多樣性研究[9-11]。常用的分子生物學技術主要有變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)、端限制性片段長度多態性(terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)及高通量測序技術等。近年來16sRNA、宏基因組、宏轉錄組等高通量測序技術通過提高測序深度和覆蓋度，實現對低豐度菌群的有效鑒定與統計，在反映整體樣本情況上更加精確，隨著測序技術和計算機軟硬件的迅猛發展，數據量巨大的宏基因組研究的成本在逐步降低，宏基因組領域的研究數量在呈指數型增長[12-13]。進一步拓展了人們對油藏微生物群落結構的認識，有助于提升對油藏微生群落結構和功能的認識。

現通過對A油田和L油田的高通量測序數據進行深入分析，解析不同溫度下水驅油藏注水井和生產井的群落結構特征，分析樣品的優勢菌屬與環境因子間的關系，為油藏微生物高效激活劑篩選提供指導，為微生物驅油技術的推廣應用奠定理論基礎。

1 分析方法

1.1 數據來源

樣品數據采集來源于NCBI(National Center for Biotechnology Information (nih.gov))。本文中A油田表示阿爾及利亞油田，L油田表示陸梁油田。通過使用R軟件(https://www.r-project.org/)和dada2包分析L油田和A油田的相關序列數據，得到相應的OTU (operational taxonomic units)以及物種注釋表等。L油田注水井包括Lu3084、Lu3064和生產井Lu3065和Lu3069。A油田注水井包括IBD、IS2、IT3和生產井PFOH1、PFOH2、PFS2[14-15]。L油田選用數據的登錄號分別為,SRX588796(Lu3064)，SRX588714(L3065)，SRX588677(Lu3084)，SRX588820(Lu3096)；A油田選用數據分別為SRX265483(IT3),SRX265484(PFS1), SRX265485(IS2),SRX265486(IBD),SRX265487(PFOH1),SRX265488(PFOH2)。兩個油田的生產井、注水井地層環境如表1所示，相關序列數信息如表2所示。

表1 A油田和L油田采樣井環境條件Table 1 Environmental conditions of sampling wells in Algeria oilfield and Luliang Oilfield

表2 有效序列數Table 2 Number of valid sequences

1.2 分析方法

1.2.1 物種組成分析

使用軟件R和SILVA庫(http://www.arb-silva.de/search/testprime/)對樣品序列進行物種比對，得到物種注釋結果，并使用phyloseq包繪制物種豐度圖[16]，同時使用TBtools軟件繪制Venn圖[17]。

1.2.2 物種多樣性分析

使用R軟件進行多樣性分析，計算物種的豐富度采用Chao1、ACE，菌群多樣性的指數采用Shannon-Wiener(H′)和Simpson(D)，H′=-∑pilnpi，其中pi=ni/N，D=∑ni(ni-1)/[N(N-1)],H′為樣品的信息含量，pi表示第i個物種占總數的比例，ni表示物種i的個體數，N為所在群落的所有物種的個體數之和。本研究中用于指數評估的OTU相似水平為100%[18-19]。

1.2.3 PcoA分析

使用軟件R和Vegan包對物種門水平和屬水平上的OTUs數據進行主坐標分析(principal coordinate analysis,PCoA)。

1.2.4 冗余分析

使用R軟件和Vegan包先做去趨勢對應分析(detrented correspondence, DCA)，根據Axis length值對采用典型相關分析(canonical correlation analysis, CCA)分析或者RDA分析進行判定，同時分析環境因子于與物種及樣本間的相關性[20]。

2 分析結果

2.1 樣本物種組成分析

通過對樣本中屬水平的物種進行統計分析得到物種相對豐度如圖1所示。由圖1(a)可知,A油田的注水井和生產井中的古菌菌種數較少，但在菌群豐度分布上差異性明顯。注水井中以甲烷嗜熱屬(Methanothermobacte，43.91%)、甲烷類菌屬(Methanosaeta，14.21%)、甲烷桿菌(Methanobacterium，5.53%)為主要菌屬。在生產井中的優勢菌屬分別為亞硝酸鹽菌屬(CandidatusNitrocosmicus，45.11%)，酵母菌(Saccharolobus，22.43%)和甲烷嗜熱菌屬(Methanothermobacter，5.36%)。由圖1(c)所示,L油田的注水井和生產井并無太大差異，都以Methanolobus為主要菌屬。在注水井中主要菌屬分別為硫球菌(Sulfophobococcus，29.5%)、亞硝酸鹽菌屬(CandidatusNitrosopumilus，15.12%)、(Methanolobus，5.16%)和(Methanomethylovorans，20.66%)。生產井種以Methanolobus(91.63%)作為主要菌屬。如圖1(b)所示,A油田注水井中的細菌以嗜溫熱菌屬(Tepidiphilus，24.35%)、脫硫弧菌(Desulfovibrio，15.52%)、海桿菌屬(Marinobacterium，9.1%)和假單胞菌屬(Pseudomonas，8.79%)為主要菌屬。在生產井中的優勢細菌菌屬分別為假單胞菌屬(Pseudomonas，23.39%)和食酸菌(Acidovorax18.82%)，能夠明顯看出注水井和生產井間的群落組成差異較大，共同優勢菌屬數量較少，僅存在一個共同優勢菌種——假單胞菌屬。如圖1(d)所示,L油田的注水井和生產井中的細菌群落組成基本保持一致，但物種豐富度較低，并且優勢菌屬上也存在顯著差異。注水井主要菌屬分別為(Denitromos，5.3%)、海桿菌屬(Marinobacterium，4.84%)。生產井中以龍血桿菌(Draconibacterium，6.95%)、假單胞菌(Pseudomonas，6.66%)和海桿菌屬(Marinobacterium，5.87%)為主要菌屬，其次還包含常見驅油菌屬芽孢桿菌(Bacillus，1.76%)。

A_Inj為A油田注水井，A_Pro為A油田生產井，L_Inj為L油田 注水井，L_Pro為L油田生產井 圖1 樣本古菌、細菌在屬水平上的物種組成圖Fig.1 Species composition diagram of sample archaea and bacteria at the genus leve

通過Venn圖分析A油田和L油田的注水井和生產井中的共有菌屬。如圖2所示，在古菌中共有菌屬數目保持一致性，數目都為2，其中A油田的生產井和生產井共有菌屬分別為甲烷嗜熱菌(Methanothermobacter)和un_f__SCGCAAA286-E23，L油田中的古菌共有菌屬分別為(甲烷球菌屬)Methanococcus和Methanolobus。但是在細菌中共菌屬數目具有較大差別，L油田的生產井和注水井共有菌屬數目163，A油田中的生產井和注水井共有菌屬數目僅有52，表明在屬水平上，L油田中的生產井和注水井間的物種相似程度要明顯高于A油田。

2.2 物種多樣性分析

Rank-abundance曲線能夠分析樣本的物種豐度和物種均度，在水平方向，物種的豐度由曲線的寬度來反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的平滑程度反映了樣本中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。如圖3所示，在A油田和L油田的Rank-abundance曲線圖中，A油田中的注水井和生產井間物種豐度和物種均度差異不明顯；L油田的注水井L3064的物種均度和物種豐度相對較高，注水井L3084和生產井間的物種均度和物種豐度差異不明顯。

2.3 PcoA分析

選取樣本門水平和屬水平上的數據，采用Bray-Curtis算法計算每個樣本的物種組成相似性，得到PCoA分析結果如圖4所示。基于門水平的PCoA分析結果能夠看出L油田中生產井和注水井之間物種相似性較低，而A油田中，處于同一區塊的生產井和注水井在物種組成上差異不明顯，如生產井PFS1和注水井IS2，生產井PFOH1、PFOH2和注水井IT3。然而在屬水平PCoA分析結果中，A油田中的注水井和生產井間的物種相似性較低，而L油田中的注水井和生產井間的物種相似性較高，呈現與門水平相反的趨勢。

數字表示4個樣本之間相交和不相交的物種數 圖2 屬水平上的OTUs分布圖Fig.2 A horizontal OTUs distribution map

圖3 Rank-abundance曲線Fig.3 Rank-abundance curve

圖4 PCoA分析圖Fig.4 PCoA analysis diagram

2.4 冗余分析

圖5 樣本和樣本群落與理化因子之間的RDA分析Fig.5 RDA analysis between samples and sample communities and physical and chemical factors

3 討論

PcoA分析結果表明A油田得注水井與生產井中的微生物群落相似性具有明顯差異，這與任紅燕等[9]關于受環境影響導致了注入水和產出液中的微生物類型差異結論具有一致性。在物種相對豐度結中，A油田的注水井和生產井間的物種組成差異較大，在分析注水井和生產井間的優勢菌群組成上，主要優勢菌屬發生明顯改變，注水井中的嗜溫熱菌屬(Tepidiphilus，24.35%)、脫硫弧菌(Desulfovibrio，15.52%)、甲烷類菌屬(Methanosaeta，14.21%)和甲烷桿菌屬(Methanobacterium，9.1%)等在生產井中占比大幅度下降，食酸菌(Acidovorax，18.82%)、Alicycliphilus(5.72%)、Acinetobacter(5.59%)等成為新的優勢菌屬，有研究表明食酸菌能夠通過對石油烴進行降解獲取代謝所需要的能量[21]，假單胞菌能夠通過降解碳氫化合物并使用硝酸鹽作為末端受體電子[22]，是作為微生物驅油的常用菌屬之一[23-24]。

此外，根據Alpha多樣性分析結果表明(表3)，A油田注水井和生產井間的物種多樣性和物種豐度差異不明顯，表明注水井中的油藏微生物對于生產井中的地層環境適應性較低，與生產井中的微生物群落在營養物質等的競爭中處于劣勢，相對豐度逐漸降低。L油田中的物種相似較高，并且在物種組成上差異不顯著，共有菌屬較多，Alpha多樣性分析結果與A油田相似，生產井和注水井間差異不明顯，這為實施微生物驅油提供了良好的基本條件。

表3 Alpha多樣性結果Table 3 Alpha diversity results

表4 DCA分析結果Table 4 DCA analysis results

4 結論

主要通過分析A油田和L油田中注水井和生產井的物種組成以及環境因子對群落組成的影響，得到以下結論。

(1)A油田的注水井和生產井中的古菌菌種數較少，但在菌群豐度分布上差異性明顯；在細菌分布上，注水井和生產井間的群落組成差異明顯。L油田的注水井和生產井的古菌并無太大差異，都以Methanolobus為主要菌屬。在細菌分布上，群落組成基本保持一致，但物種豐富度較低，并且優勢菌屬上也存在顯著差異。

(2)A油田和L油田中的注水井和生產井間物種豐度和物種均度差異不明顯，此外，兩油田間的物種豐度和物種多樣性差異不顯著。

(3)在屬水平上，A油田中的注水井和生產井間的物種相似性較低，而L油田中的注水井和生產井間的物種相似性較高。