郭倩，李雅琪，萬生芳，魏昭暉，王同亮，李榮科，張磊，舒暢，李亞玲，楊雅麗

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.中國藥科大學，江蘇 南京211298

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿?。╠iabetes mellitus）常見的慢性并發癥，可見于60%以上糖尿病患者。DGP發病機制復雜，與自主神經病變、胃腸激素紊亂、胃組織細胞病變、高血糖、氧化應激等因素密切相關。DGP屬中醫學“痞滿”“嘔吐”“反胃”等范疇，主要由脾氣虛弱，脾失轉運，營氣化生無源所致，治療以補益脾氣為主。紅芪是甘肅道地藥材，具有補氣健脾、生津養血等功效，紅芪多糖是其主要活性成分，具有調節機體細胞免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等作用。課題組前期研究發現，紅芪多糖能夠降低DGP大鼠血糖，促進胃動力、胃排空及胃激素分泌，保護和修復胃平滑肌細胞及胃黏膜損傷，上調小腸組織c-Kit、Cx43基因和蛋白表達?；谇捌谘芯?，本實驗觀察DGP大鼠小腸組織肌電活動，結合氧化應激相關指標檢測，進一步探討紅芪多糖促進腸動力、抑制氧化損傷的機制，為指導其臨床應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠，8 周齡，體質量180～200 g，甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（甘）2015-0002。飼養于甘肅中醫藥大學SPF級實驗室，溫度23 ℃、相對濕度50%環境。本實驗經甘肅中醫藥大學實驗動物中心動物倫理委員會審批（2020-041）。

1.2 藥物

紅芪多糖，寶雞市方晟生物開發公司，純度72.4%，批號20200315，臨用前用純凈水溶解，制成濃度分別為12、6、3 mg/mL溶液。枸櫞酸莫沙必利分散片，批號190614，成都康弘藥業集團股份有限公司，5 mg/片，將藥品粉碎，用純凈水溶解，制成濃度為0.35 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

水合氯醛，天津市大茂化學試劑廠，批號20 190504；鏈脲佐菌素（STZ），美國VETEC 公司，批號WXBD0304V；活性氧（ROS）試劑盒，江蘇酶標生物，批號MB-6608A；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、8-羥基脫氧鳥苷酸（8-OHdG）、丙二醛（MDA）試劑盒，上海酶聯生物，批號分別為ml059387、ml097316、ml028318、ml 077384；Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Keap1）抗體、核因子E2相關因子（Nrf2）抗體、血紅素加氧酶-1（HO-1）抗體，英國Abcam 公司，批號分別為ab139729、ab92946、ab68477；硫氧還蛋白（Trx）抗體，美國Affinity公司，批號DF7621；血糖試紙，羅氏血糖健康醫護公司，批號 478151；β-actin一抗，美國Affinity公司，批號AF-7018-100；辣根過氧化物酶標記二抗，美國Affinity公司，批號S0001；DAB顯色液，北京中杉金橋生物技術有限公司，批號PV-6000D；Super ECL Plus超敏發光液，北京普利萊基因科技有限公司，批號P10100。ML408 生物電放大器（澳大利亞ADInstruments），PL3508生理信號采集系統（澳大利亞ADInstruments），Accu-Chek Performa型血糖儀（瑞士羅氏），XYJ80-2電動離心機（常州市金壇恒豐儀器廠），Infinite M200 Pro多功能酶標儀（瑞士Tecan），電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad 公司），AUW220D 半微量電子天平（日本島津公司），FRESCO 21 高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 造模、分組及給藥

將72 只大鼠適應性飼養1 周后隨機分為空白組12只和造模組60只。禁食不禁水12 h，造模組大鼠按55 mg/kg一次性腹腔注射1%STZ溶液（0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液配制），空白組大鼠注射等體積0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液。72 h后尾靜脈采血，測定隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠。糖尿病大鼠以高糖高脂飼料不規則喂養（單日上午進食，雙日下午進食），連續4周，測定血糖≥16.7 mmol/L，并伴有飲水量增加、腹部脹大、體質量明顯減輕等表現，隨機抽取空白組與造模組各2只大鼠檢測小腸肌電活動，造模組大鼠較空白組小腸自主收縮頻率顯著降低，提示造模成功。根據實際成模大鼠數量并綜合考慮模型大鼠死亡率，將成模大鼠隨機分為模型組11只，陽性藥組和紅芪多糖高、中、低劑量組各10只，另設空白組10只，空白組予普通飼料喂養，其余各組繼續高糖高脂飼料喂養。按照人與大鼠體表面積換算給藥劑量，陽性藥組予枸櫞酸莫沙必利溶液3.5 mg/kg灌胃，紅芪多糖高、中、低劑量組分別予紅芪多糖溶液0.12、0.06、0.03 g/kg灌胃，灌胃體積2 mL/只，空白組和模型組灌胃等體積純凈水，連續8周。

1.5 小腸肌電活動檢測

實驗前大鼠禁食24 h、禁水2 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉，有齒鑷刺激大鼠四肢，無疼痛反射且角膜反射存在時開始實驗。大鼠仰臥位固定于恒溫解剖臺，腹部備皮，常規消毒。劍突下沿上腹正中線剖開，切口2～4 cm，暴露小腸，于距離回盲部約2 cm處回腸上置入銀針電極，測量電極置于腸壁漿肌層（電極直徑0.3 mm，回盲部交界處接正極，向左旁開約0.3 cm處胃體接負極），參考電極夾于大鼠皮下，電極輸入端與生物機能實驗系統連接，進行信號采集。實驗參數：采樣率1 k/s，量程20 mV，低通20 Hz，高通0.3 Hz，50 Hz陷波為開，電源濾波器為開。檢測過程中腸管上方覆蓋溫生理鹽水紗布以減少體溫流失，并關注大鼠麻醉狀態，若出現頭部等活動或四肢收縮，則適量追加麻醉，使大鼠處于平穩麻醉狀態，便于觀察。波形平穩后，連續記錄60～80 min，以5 min為一個時間段，每個數據樣本截取基線平穩的波形，隨機截取6個時間段，計算大鼠各時間段小腸組織肌電慢波頻率和振幅，取其平均值，采用Lab Chart8 Reader軟件讀取分析。

1.6 ELISA檢測

給藥結束后大鼠禁食24 h、禁水2 h，10%水合氯醛腹腔注射（0.33 mL/100 g）麻醉，分離小腸組織，剪取100 mg小腸組織于玻璃勻漿器中，加入1 mL生理鹽水，冰浴條件下勻漿，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，吸取上清液，采用ELISA檢測小腸組織ROS、SOD、GSH-Px、8-OHdG和MDA水平。

1.7 Western blot檢測

剪取約100 mg小腸組織，加入1 mL RIPA裂解液，冰上充分研磨，勻漿4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，充分混勻后，100 ℃水浴加熱10 min，冷卻至室溫后再次離心5 min，取上清液上樣，5%濃縮膠與10%分離膠進行電泳。冰浴、200 mA轉膜60 min，將蛋白轉至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 洗滌3 次，滴加Keap1 一抗（1∶1 000）、Nrf2一抗（1∶1 000）、Trx一抗（1∶1 000）、HO-1一抗（1∶10 000）、β-actin一抗（1∶10 000），4 ℃孵育過夜。次日取出條帶，TBST清滌3次，滴加二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h。ECL 發光液顯影，采用凝膠成像分析儀采集圖像，Image J 軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白與內參蛋白灰度值比值計算蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 紅芪多糖對模型大鼠小腸組織肌電活動的影響

與空白組比較，模型組大鼠小腸組織肌電慢波頻率和振幅明顯降低，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和紅芪多糖高、中劑量組大鼠小腸組織肌電慢波頻率和振幅明顯升高，差異有統計學意義（＜0.01）。見表1、圖1。

圖1 各組大鼠小腸組織肌電活動

表1 各組大鼠小腸組織肌電慢波頻率和振幅比較（）

2.2 紅芪多糖對模型大鼠小腸組織活性氧、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、8-羥基脫氧鳥苷酸、丙二醛水平的影響

與空白組比較，模型組大鼠小腸組織ROS、8-OHdG、MDA水平明顯升高，SOD、GSH-Px水平明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和紅芪多糖高、中劑量組大鼠小腸組織ROS、8-OHdG、MDA水平明顯降低，SOD、GSH-Px 水平明顯升高（＜0.05，＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠小腸組織ROS、SOD、GSH-Px、8-OHdG、MDA水平比較（，ng/mL）

2.3 紅芪多糖對模型大鼠小腸組織Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1、核因子E2相關因子、血紅素加氧酶-1、硫氧還蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠小腸組織Keap1蛋白表達明顯升高，Nrf2、HO-1、Trx蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和紅芪多糖高、中劑量組大鼠小腸組織Keap1蛋白表達明顯降低，Nrf2、HO-1、Trx蛋白表達明顯升高，差異均有統計學意義（＜0.05，＜0.01）。見圖2、表3。

表3 各組大鼠小腸組織Keap1、Nrf2、HO-1、Trx蛋白表達比較（）

圖2 各組大鼠小腸組織Keap1、Nrf2、HO-1、Trx蛋白免疫印跡

3 討論

DGP是糖尿病常見慢性并發癥，我國糖尿病患病率人數高居全球首位，其中有5年以上糖尿病病史的患者中，有超過一半患者存在胃輕癱癥狀，臨床表現多為餐后飽脹、厭食、腹脹、嘔惡等，嚴重影響患者生活質量。中醫學認為，消渴日久，損傷脾氣，脾氣虛則升降功能失調，轉運失常。其根本病機為脾氣虛弱，失于健運，治當補氣健脾。紅芪為補氣之要藥，其重要組分紅芪多糖可以改善胰島素抵抗，阻止或延緩2型糖尿病并發癥。研究表明，紅芪多糖通過增加Nrf2表達影響抗氧化酶類表達，從而調控氧化應激反應，改善糖尿病心肌病小鼠心肌損傷；通過上調Bcl-2/Bax表達，抑制脾虛型糖尿病大鼠胃竇組織胃黏膜細胞凋亡。

氧化應激是機體氧化和抗氧化失衡引起ROS 異常增多的一種病理表現，是心血管和代謝疾病的主要致病因素，也是影響DGP 的重要因素之一。8-OHdG、MDA、SOD和GSH-Px 是衡量機體氧化應激水平的常用指標。高血糖可使ROS異常增多，氧自由基增加，機體抗氧化能力降低，代謝失常。SOD、GSH-Px是體內重要的抗氧化酶，可反映機體的抗氧化水平，有效清除氧自由基，維持機體氧化平衡。研究表明，抑制氧化酶表達能提高ROS和MDA含量，引起氧化應激。而氧化應激參與DGP的發生發展，是DGP發病的重要機制。

Keap1/Nrf2信號通路是抗氧化應激的經典信號通路，Keap1是氧化還原反應的傳感器，通過氧化還原反應使構象發生變化從而使Nrf2解離，轉入細胞核內與Maf蛋白結合成異質二聚體后與抗氧化反應元件結合，激活調控Ⅱ相代謝酶、抗氧化酶或藥物轉運體的轉錄活性，發揮抗氧化損傷作用，恢復細胞內穩態。Keap1是氧化應激的關鍵蛋白，能提高機體對心肌微血管內皮細胞的保護作用，協調氧化應激，緩解機體氧化損傷。Nrf2是該信號通路中重要的細胞保護性轉錄因子。當機體發生氧化應激時，Nrf2與Keap1解偶聯，活化的Nrf2轉運進入細胞核，與抗氧化反應元件結合，激活下游抗氧化酶如HO-1、Trx等表達并誘導下游抗氧化酶如SOD、GSH-Px基因轉錄，從而保護細胞免受ROS 導致的損傷。HO-1 和Trx 是Keap1/Nrf2 信號通路激活的重要抗氧化酶，能夠清除過量ROS，維持細胞氧化/抗氧化平衡。因此，HO-1和Trx的活性對減輕機體氧化應激程度，維持氧化平衡狀態有重要意義。

本實驗中模型組大鼠小腸組織Keap1蛋白表達顯著升高，Nrf2、HO-1、Trx蛋白表達顯著降低，ROS、8-OHdG及MDA水平顯著升高，SOD和GSH-Px水平顯著降低，這可能是導致DGP大鼠小腸肌電活動慢波頻率與振幅降低、出現氧化應激損傷的原因之一。經藥物干預后，陽性藥組和紅芪多糖高、中劑量組大鼠小腸組織Keap1蛋白表達顯著降低，Nrf2、HO-1、Trx蛋白表達顯著升高，ROS、8-OHdG及MDA水平顯著降低，SOD和GSH-Px水平顯著升高，小腸肌電活動慢波頻率與振幅顯著升高，提示機體抗氧化應激能力明顯改善。

綜上，紅芪多糖能改善DGP大鼠小腸動力，其機制與上調氧化應激關鍵蛋白Nrf2、HO-1、Trx 表達，下調Keap1蛋白表達，降低ROS、8-OHdG及MDA水平，升高SOD和GSH-Px水平有關。本結果為課題組進一步探討紅芪多糖治療DGP胃腸動力障礙的機制提供實驗依據，也為中藥治療DGP 提供新思路、新方法。