基于Th1/Th2平衡研究青蒿油對特應性皮炎小鼠模型的干預作用

黃 虎，楊志波，萬江波，陶 侃，郭莉莉，秦紫嫣，何彰華，毛必瑤

（1.上海上美化妝品股份有限公司，上海 200065；2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院皮膚科，湖南 長沙 410005；3.昆藥集團股份有限公司，云南 昆明 650106；4.湖南謳睿生物科技有限公司，湖南 長沙 410205）

特應性皮炎（atopic dermatitis）是最常見的慢性炎癥性皮膚病，病因復雜多樣，以皮膚敏感干燥、局部或播散性濕疹病變，且伴有嚴重的瘙癢感覺為其發病表型[1-3]。特應性皮炎多數病例開始于嬰兒期和兒童期，成年期亦有發生，且越來越多的證據表明特應性皮炎在成人中更為常見[4]。目前研究發現[5，6]，青蒿素及其衍生物具有抗菌消炎、免疫調節的作用，對治療皮膚病具有良好效果。青蒿油（artemisia naphta oil，AN）作為青蒿素的副產物，也表現出了對痤瘡等皮膚病的抑制作用，在皮膚病外治方向具有廣闊的應用前景[7]。因此，本研究擬探究AN對卡泊三醇誘導構建的特應性皮炎小鼠的干預作用及具體機制，旨在為延緩特應性皮炎病情進展提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 96只6周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠[湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證編號：430727210103183337，生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，并通過湖南中醫藥大學第二附屬醫院動物倫理委員會批準，嚴格遵循國家動物飼養規則飼養1周后進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 試劑 無菌無酶水、4%多聚甲醛、HE染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司），吐溫20、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司），卡泊三醇（上海源葉生物科技有限公司），酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司），AN（上海上美化妝品股份有限公司）。

1.2.2 AN的提取 將青蒿葉與石油醚加熱，過濾得到AN溶液，加熱溶液，蒸發去除溶液內的石油醚。在100℃～110 ℃下蒸餾，獲得AN的粗產物。將AN的粗產物放入精煉罐中110 ℃加熱30 min后冷卻。在AN中加入硅膠，攪拌30 min后過濾脫色。

1.2.3 分組及模型構建 96只C57BL/6小鼠適應性喂養1周后根據隨機數字表法分為Control組、Model組、NC組、0.5% AN組、1.0% AN組、1.5% AN組、3.0% AN組、5.0% AN組，各12只。Control組不做任何處理，其余7組均用20 μl的50 nmol/ml卡泊三醇涂抹小鼠左耳，1次/2 d，持續使用2周，進行特應性皮炎模型構建。此外NC組在造模期間噴涂吐溫水溶液1 ml，1次/d；而不同濃度的AN組則每天分別噴涂1 ml 0.5%、1.0%、1.5%、3.0%、5.0%的AN（換算成人體使用濃度依次為0.055%、0.11%、0.16%、0.3%和0.55%）。實驗結束后收集小鼠耳部皮膚組織以及血清樣本，用于后續檢測。

1.3 觀察指標 于干預2周后觀察小鼠耳部皮膚損傷、組織病理變化、相關炎癥因子水平。

1.3.1 小鼠耳部皮膚損傷 觀察各組小鼠左耳皮膚損傷變化，并用游標卡尺對各組小鼠的左耳耳尖厚度進行測量，觀察AN對特應性皮炎小鼠的耳部皮膚組織的作用。

1.3.2 組織病理變化 采用HE染色觀察皮膚組織病理變化，收集各組小鼠的左耳皮膚組織，以4%多聚甲醛溶液固定，經脫水和透明處理，石蠟包埋后切片，再用蘇木素-伊紅染色，封片后于光學顯微鏡下觀察各組小鼠的皮膚組織病理變化。

1.3.3 相關炎癥因子 采用ELISA法檢測相關炎癥因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、IgE）水平，收集小鼠血清、耳朵勻漿，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，用酶標儀測定波長450 nm處吸光度值，繪制標準曲線，根據標準曲線計算小鼠相關炎癥因子的含量。

1.4 統計學方法 使用Graphpad 8.0統計學軟件處理數據，計量資料采用（±s）表示，組間比較行t檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組耳部厚度及皮膚變化比較 Control組耳部皮膚組織完好；與Control組相比，Model組左耳存在肉眼可見的紅腫現象，并伴有毛細血管擴張；與Model組和NC組相比，不同濃度AN處理組左耳的紅腫及毛細血管擴張現象得到不同程度的改善，且隨著AN干預濃度的增加，修復效果也不斷提升，見圖1。利用游標卡尺測量小鼠左耳耳尖的厚度發現，Model組左耳厚度大于Control組（P＜0.05）；NC組和不同濃度AN處理組左耳厚度小于Model組（P＜0.05）；1.0%、1.5%、3.0%、5.0% AN組左耳厚度均小于NC組（P＜0.05），見表1。

表1 各組左耳厚度比較（，cm）

表1 各組左耳厚度比較（，cm）

注：與Control組比較，*P＜0.05；與Model組比較，#P＜0.05；與NC組比較，&P＜0.05

組別Control組Model組NC組0.5% AN組1.0% AN組1.5% AN組3.0% AN組5.0% AN組n 12 12 12 12 12 12 12 12左耳厚度0.21±0.01 0.46±0.03*0.36±0.04#0.30±0.05#0.31±0.06#&0.28±0.04#&0.28±0.04#&0.26±0.04#&

圖1 各組左耳皮膚組織變化情況

2.2 各組左耳皮膚組織HE染色結果比較 Model組左耳表皮層及角質層厚度大于Control組；1.0%、1.5%、3.0%、5.0% AN組左耳表皮層及角質層厚度小于Model組和NC組，見圖2。

圖2 各組左耳皮膚組織HE染色結果（×200）

2.3 各組血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IgE水平比較 各組間血清TNF-α水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；Model組血清IL-1β、IL-6、IgE水平均高于Control組（P＜0.05）；0.5%及以上濃度AN組血清IL-1β水平均低于Model組（P＜0.05）；1.0%、1.5%、3.0%、5.0%AN組血清IL-6水平均低于Model組（P＜0.05）；各AN組血清IgE水平均低于Model組（P＜0.05）；1.0%、1.5%、3.0%、5.0% AN組血清IL-1β、IL-6、IgE水平均低于NC組（P＜0.05），見表2。

表2 各組血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IgE水平比較（，pg/ml）

表2 各組血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IgE水平比較（，pg/ml）

注：與Control組比較，**P＜0.05；與Model組比較，#P＜0.05，##P＜0.05；與NC組比較，&P＜0.05，&&P＜0.05

組別Control組Model組NC組0.5% AN組1.0% AN組1.5% AN組3.0% AN組5.0% AN組n IL-1β 12 12 12 12 12 12 12 12 71.51±18.69 116.94±10.10**111.51±14.98 104.94±12.49#IL-6 57.93±5.77 100.73±9.63**97.73±13.04 93.25±12.22 IgE 6.29±1.74 11.64±1.88**9.54±1.94#8.34±1.11#87.36±8.72##&&84.51±11.50##&7.15±1.48##&74.82±8.23##&&70.00±9.42##&&6.31±1.01##&&96.24±14.91##&76.02±10.17##&7.32±1.41##&&88.98±5.97##&TNF-α 37.92±5.22 39.53±4.69 36.25±6.36 36.46±3.91 35.88±3.91 34.90±6.47 37.68±3.72 35.11±5.86 80.89±9.72##&&6.77±1.37##&&

2.4 三組耳朵勻漿中IL-4、IL-5、TSLP、IFN-γ水平比較 Model組耳朵勻漿IL-4、IL-5、TSLP水平均高于Control組，IFN-γ水平低于Control組（P＜0.05）；1.5% AN組耳朵勻漿IL-4、IL-5、TSLP水平均低于Model組，IFN-γ水平均高于Model組（P＜0.05），見表3。

表3 三組耳朵勻漿中IL-4、IL-5、TSLP、IFN-γ水平比較（，pg/ml）

表3 三組耳朵勻漿中IL-4、IL-5、TSLP、IFN-γ水平比較（，pg/ml）

注：與Control組比較，**P＜0.05；與Model組比較，##P＜0.05

組別Control組Model組1.5% AN組n 12 12 12 IL-4 8.75±2.15 37.72±5.57**13.71±2.38##IL-5 9.51±2.68 40.20±5.05**14.70±2.36##TSLP 9.46±2.53 30.49±6.79**14.72±2.6##IFN-γ 61.79±7.71 15.16±2.43**35.59±2.85##

3 討論

特應性皮炎是一種慢性、復發性、炎癥性皮膚病，發病原因與遺傳、免疫和環境之間的復雜相互作用有關，其特征外在表現為皮膚屏障受損，內在表現則為促進炎癥反應活化，使患者血清中炎癥因子水平顯著高于正常人群[8]。臨床常用糖皮質激素、免疫抑制劑進行治療，但是不適合長期使用且存在副作用[9，10]。因此，特應性皮炎亟需尋找有效且安全的治療方法。近年來，隨著對青蒿素認識的逐漸加深，發現其在治療炎癥性皮膚病中具有重要意義。AN作為青蒿素的副產物，也可用于治療神經性皮炎、皮膚真菌病、痤瘡等皮膚疾病，且與臨床上常用藥劑相比，其耐受性強且不易產生不良反應[11]。

本研究結果顯示，Model組左耳呈現紅腫現象，且伴有毛細血管擴張，左耳厚度、左耳表皮層及角質層厚度大于Control組；不同濃度AN處理組小鼠左耳的紅腫及毛細血管擴張程度、左耳厚度、左耳表皮層及角質層厚度小于Model組，且隨著AN干預濃度的增加，修復效果也不斷提升。分析認為，特應性皮炎患處皮膚常出現紅腫、皮膚增厚等現象，AN可改善特應性皮炎的病理變化，在緩解特應性皮炎進展過程中發揮重要作用。同時，Model組血清IL-1β、IL-6、IgE水平均高于Control組（P＜0.05）；1.0%及以上濃度AN組血清IL-1β、IL-6、IgE水平均低于NC組（P＜0.05）。分析認為，特應性皮炎是炎癥性皮膚病，機體中的相關炎癥因子水平發生改變，促進炎癥的進展；而青蒿素及其衍生物可通過抑制相關促炎因子的產生以改善炎癥性皮膚病的嚴重程度，緩解疾病進展[12]。即1.0%（對應人體使用濃度0.11%）及以上濃度AN能舒緩特應性皮炎小鼠的炎癥反應以及相關疾病表型在特應性皮炎的治療方面具有巨大應用前景。T淋巴細胞的異常活化和浸潤介導的免疫功能失調是特應性皮炎疾病進展中的重要因素，其中輔助性T細胞Th1/Th2軸在特應性皮炎發生發展中處于關鍵地位[13]。特應性皮炎患者機體中調節性T細胞的功能和數量均受到不利影響，機體對Th2細胞的抑制作用減弱，導致Th2細胞的功能亢進，引發一系列的炎性反應，進而促進特應性皮炎進展[14]。本研究結果還顯示，Model組耳朵勻漿IL-4、IL-5、TSLP水平均高于Control組，IFN-γ水平低于Control組（P＜0.05）；1.5% AN組耳朵勻漿IL-4、IL-5、TSLP水平均低于Model組，IFN-γ水平均高于Model組（P＜0.05）。分析認為，TSLP是一種新型促敏分子，被譽為炎癥反應的“總開關”，可誘導淋巴結內的Th0細胞向Th2型細胞分化，使得Th1/Th2的平衡機制向Th2傾斜，在驅動特應性皮炎疾病進展中發揮重要作用[15]。IL-4、IL-5是由Th2細胞分泌，IFN-γ是由Th1細胞分泌。因此，AN可調節Th2細胞向Th1細胞漂移，改變局部微環境中細胞因子的組成，減輕炎癥反應，緩解皮膚損傷，是針對特應性皮炎干預的有效手段。

綜上所述，本研究通過動物模型疾病表征、組織病理變化情況以及相關炎癥因子的表達情況，明確了AN可通過改善特應性皮炎小鼠機體Th1/Th2平衡，減輕炎癥反應，緩解皮膚損傷。