微波消解-石墨爐原子吸收光譜法測定食用菌中總砷

宋 玥 周天慧 張 萍 姚曉慧 劉麗萍* 韓丹丹

(1.河北大學 公共衛生學院，河北 保定 071002；2.北京市疾病預防控制中心，食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室，北京 100013；3.珀金埃爾默企業管理(上海)有限公司,上海 200131)

砷是公認的致癌物，人群主要通過受污染的飲用水、食品、空氣等暴露砷[1]。長期低劑量暴露砷，可罹患皮膚癌等多種疾病。當土壤、水等環境中砷含量高時會對農作物造成污染，食用受砷污染的食品將對健康造成嚴重危害。我國對食品、飲用水中砷的限量進行了嚴格的規定。

食用菌以其獨特的美味成為人們日常喜愛的食品，研究表明食用菌易積累各種重金屬，文獻[2]報道食用菌極易富集砷。食品安全國家標準 GB 2762—2017《食品中污染物限量》中規定，食用菌中總砷限量為0.5 mg/kg，《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》GB 5009.11—2014中砷的檢測方法有電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)、氫化物原子熒光光譜法、銀鹽法。ICP-MS操作簡便、靈敏度高，是目前元素分析最強有力的分析技術[3]，但也因其價格昂貴、氬氣消耗量高，限制了其廣泛使用；氫化物原子熒光光譜法雖廣泛應用于不同的實驗室[4]，但由于檢測原理的要求，樣品前處理時需將樣品中不同形態的砷全部消解為三價砷或五價砷，對于砷形態復雜的食用菌，樣品前處理繁瑣，消解時間長，簡便快捷的微波消解技術的使用受到限制；銀鹽法靈敏度低，操作煩瑣，適用性差。

石墨爐原子吸收光譜法具有靈敏度高、選擇性好等優勢，廣泛應用于食品中鉛、鎘的分析檢測。以往由于砷的空心陰極燈能量低，限制了石墨爐原子吸收測定砷的使用，隨著砷的高性能燈、無極放電燈的推出和使用，目前石墨爐原子吸收光譜法已應用于食用油[5-6]、茶葉[7]、土豆[8]、保健品[9]、大米[10]、雞肉[11]、乳及乳制品[12]、高鹽食品[13]、天然藥材[14]等樣品中總砷的測定。食用菌中總砷超標被屢屢報道[15]，研究表明不同食用菌中砷形態復雜[16-18]，本文采用微波消解-石墨爐原子吸收光譜技術對食用菌中總砷進行分析研究，為不同實驗室測定食用菌中總砷提供一種快速、準確、經濟的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

美國PerkinElmer公司PinAcle900T原子吸收光譜儀(附自動進樣器和石墨爐)，砷無極放電燈，iCAP RQ 型電感耦合等離子體質譜儀、U3000型HPLC高效液相色譜儀、Dionex IonPac AS7 色譜柱(4 mm×250 mm)賽默飛世爾科技有限公司；Milli-Q Integral超純水處理系統(美國Millipore公司)，Mettler Toledo電子天平，TOPEX+ 微波消解儀、G-400趕酸儀(上海屹堯儀器科技發展公司)，Grinder HM100 研磨儀，德國MMM公司Venticell高溫烘箱。

砷標準儲備液(100 mg/L，中國計量科學研究院)，硝酸(65%，德國Merck)，過氧化氫(30%，國藥集團化學試劑有限公司)，碳酸銨(優級純)，硝酸鈀[Pd(NO3)2，1 g/L]，亞砷酸根As(Ⅲ，GBW08666)、一甲基砷酸(MMA，GBW08668)、二甲基砷酸(DMA，GBW08669)、砷酸根As(V，GBW08667)、砷甜菜堿(AsB，GBW08670)、砷膽堿(AsC，GBW08671)等砷形態標準溶液均購于中國計量科學院。實驗中所用試劑為優級純，分析用水均為超純水。

1.2 樣品前處理

將市場購買的食用菌(干劑)樣品去除不可食部分，粉碎研磨均勻后儲存于聚乙烯管中。稱取粉碎均勻的食用菌試樣0.25 g(精確到0.000 1 g)于微波消解罐中，加入6 mL硝酸和1 mL過氧化氫，預消解2 h，放入微波消解系統中按微波消解程序(見表1)進行消解。消解完全后于140 ℃趕酸至0.5 mL，用超純水定容至25 mL，混勻待測，同時做空白實驗。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedure

1.3 儀器工作條件

測定時采用塞曼背景校正，硝酸鈀(1 g/L)為基體改進劑，進樣體積為5 μL，樣品進樣體積為20 μL，石墨爐原子吸收光譜儀的工作條件設定為：波長193.7 nm，燈電流(無極放電燈)440 mA，狹縫 0.7 nm。石墨爐升溫程序見表2。

表2 石墨爐升溫程序Table 2 Furnace program

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

測定總砷時樣品前處理方法主要有微波消解法、電熱板消解法、干灰化法、石墨消解法。采用原子熒光光譜法測定砷時由于原理所限，不同樣品中砷的存在形式不同，一般選擇電熱板消解、干灰化法或石墨消解法，保證樣品消解完全至關重要。石墨爐原子吸收光譜法測定樣品中總砷時，其原子化階段的高溫可以將不同形態的砷原子化。由于干灰化法時需要加入灰化輔助劑，會引入過多的干擾，避免選用。電熱板和石墨消解法操作繁瑣，需要加入大量強酸，且消化時間長；微波消解法操作簡單，消解能力強，用時短[19]。本文選擇微波消解進行樣品前處理，由于樣品消解后消解液中的酸濃度較高，測定時會導致較高的背景，且也會對石墨管造成不可逆的損壞，因此消解后要進行趕酸處理[20]。經對趕酸溫度進行優化，結果表明趕酸溫度低于120 ℃時，趕酸時間過長，影響工作效率；趕酸溫度高于150 ℃時，不好把控趕酸的終點，也會造成砷的損失。經實驗選擇趕酸溫度為135～145 ℃，3 h可完成趕酸過程。

2.2 樣品預處理選擇

實驗發現個別干劑食用菌樣品基質復雜，背景吸收較高，無法準確測定砷含量。進一步研究發現消解液中殘存少許無機鹽，可能為樣品預處理不完全所致，帶入了外源性的土壤顆粒等雜質，影響了測定的準確性，經對干劑食用菌進行泡發，除去根部粘帶的土壤顆粒等雜質，可消除此現象。建議干劑食用菌預處理時一定要去除食用菌根部粘帶的雜質，取可食部分進行預處理，粉碎均勻，保障樣品的代表性。

2.3 基體改進劑的選擇

基體改進劑不僅能改善基體性能，使基體轉化為易揮發的化學形態，以利于在灰化階段驅盡，且能改善被測元素的性能，使之轉化為更穩定或更易揮發的形態，以使用更高的灰化溫度除盡基體雜質而被測元素又不損失，或先于基體揮發以避免基體的干擾。砷是易揮發元素，需要加入基體改進劑，提高灰化溫度，降低背景干擾。鈀和鎳都可以提高灰化溫度，但是鈀的靈敏度比鎳高[21]。硝酸鈀是石墨爐原子吸收光譜法測定砷的常用基體改進劑[22-24]，其能與待測組分砷結合成更穩定的化合物，有效提高灰化溫度，降低背景干擾。本實驗選擇硝酸鈀為基體改進劑，測試了無基體改進劑和加入基體改進劑硝酸鈀時食用菌消解液的吸光度，結果見圖1，不加基體改進劑時，待測元素損失較多，背景峰很高，無法準確測定。

圖1 未加基體改進劑和加入基體改進劑時樣品消解液的吸收峰和背景峰Figure 1 The absorption peak and background peak of sample digestion solution without and with matrix improver.

對基體改進劑硝酸鈀濃度進行優化，分別配制0.1、0.5、1.0、1.5和2.0 g/L的硝酸鈀溶液進行實驗，結果見圖2和圖3，硝酸鈀作為基體改進劑時，濃度在0.5、1.0、1.5和2.0 g/L時對吸光度的影響差別不大，但是1 g/L的峰形圖最好，因此本研究選用1 g/L硝酸鈀作基體改進劑。

圖2 基體改進劑濃度與吸光度曲線圖Figure 2 Matrix improver concentration and absorbance curve.

圖3 不同濃度基體改進劑中食用菌樣品消解液的峰形圖對比Figure 3 Comparison of peak patterns of digestion solution of edible mushrooms samples in different concentrations of matrix improvers.

2.4 石墨爐升溫程序的優化

灰化溫度和原子化溫度是石墨爐原子吸收光譜法分析中的兩個關鍵溫度。

2.4.1 灰化溫度的選擇

灰化的作用是盡量將與被測元素共存的基體除去，避免在原子化階段對目標元素的原子化效率產生影響，同時防止基體成分在測定波長區域產生非特征的背景吸收。灰化溫度過高會造成被測元素的損失，使方法靈敏度降低；灰化溫度過低，會造成背景偏高，且對原子化階段產生干擾。

分別在800～1 400 ℃測定某食用菌樣品，如圖4和圖5所示，實驗結果表明，灰化溫度在1 200 ℃時吸光度高，峰形較好，因此選擇1 200 ℃作為灰化溫度進行后續實驗。

圖4 灰化溫度對吸光度的影響Figure 4 The effect of pyrolysis temperature on absorbance.

圖5 不同灰化溫度的峰形圖對比Figure 5 Comparison of peaks at different ashing temperatures.

2.4.2 原子化溫度的選擇

原子化階段的目的是將處于分子或離子狀態的目標元素通過熱分解的作用使其變成處于基態的自由原子。原子化溫度過高，導致噪音增加及石墨管壽命降低；原子化溫度過低，會使吸收峰變的平坦且吸光度值變小。

分別在1 900～2 400 ℃測定某食用菌樣品，如圖6和圖7所示，實驗結果表明，原子化溫度在2 300 ℃時吸光度較高，峰形較好，因此選擇2 300 ℃為原子化溫度。

圖6 原子化溫度對吸光度的影響Figure 6 The effect of atomic temperature on absorbance.

圖7 不同原子化溫度的峰形圖對比Figure 7 Comparison of peaks at different atomization temperatures.

2.5 方法學考察

2.5.1 線性范圍及檢出限

采用砷標準溶液逐級稀釋后分別配制成濃度為0、2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0和30.0 μg/L的標準系列溶液進行線性范圍實驗，線性方程見表4。采用空白溶液測定檢出限，測定11次空白溶液，根據檢出限計算公式LOD=3SD/b(b為工作曲線斜率)和定量限計算公式LOQ=10SD/b(b為工作曲線斜率)測得檢出限為0.4 μg/L，定量限為1.30 μg/L，當樣品取樣量為0.25 g，定容體積為25 mL時，方法檢出限為0.04 mg/kg，方法定量限為0.13 mg/kg，結果見表3。

表3 線性范圍及檢出限Table 3 Linear range and detection limit

2.5.2 方法的準確性和重現性實驗

以精密度考察方法的重現性，以加標回收實驗和有證標準物質考察方法準確性。

2.5.2.1 精密度和加標回收實驗

選用市售香菇和銀耳，分別添加三個不同濃度水平的砷標準溶液進行加標回收和精密度實驗，實驗結果顯示三個濃度水平的加標回收率均在80.6%～104%。三個濃度水平的相對標準偏差RSD均小于6.6%，結果見表4。

表4 香菇、銀耳加標回收率和精密度Table 4 Spiked recovery and precision of lentinus edodes and tremella (n=6) /(mg·kg-1)

2.5.2.2 實際樣品的精密度

選取三個不同濃度砷含量的食用菌樣品進行方法精密度考察，平行制備6個樣品，測定總砷含量，結果見表5，RSD值均小于5.0%。

表5 實際樣品精密度測定結果Table 5 Actual sample precision measurement results (n=6) /(mg·kg-1)

2.5.2.3 有證標準物質測定

由于沒有含砷高的食用菌基體標準物質，采用其他基質的有證標準物質考察方法的準確性，測定結果見表6。結果顯示，測定值均在標準值范圍內。

表6 標準物質測定結果Table 6 Standard material determination results(n=6) /(mg·kg-1)

2.6 實際樣品的分析

采集市售食用菌樣品，按所建方法進行樣品中總砷含量測定，結果如表7所示。

表7 實際樣品測定結果Table 7 Actual sample determination results

GB 2762—2017規定，食用菌及其制品總砷限量指標為0.5 mg/kg，編號為Y3、Y6、Y7、Y8的食用菌已超出限量范圍，屬超標樣品。由于石墨爐測定砷含量線性范圍較窄，對于砷含量較高，超過標準曲線范圍的樣品應稀釋到標準曲線范圍內再進行測定，以得到準確可靠的結果。如圖8和圖9所示，樣品稀釋后的背景峰更低，吸收峰形更好。

圖8 Y6與Y6稀釋5倍后的吸收峰和背景峰對比圖Figure 8 Contrast diagram of absorption peak and background peak of Y6 and Y6 diluted by 5 times.

圖9 Y7與Y7稀釋5倍后的吸收峰和背景峰對比圖Figure 9 Contrast diagram of absorption peak and background peak of Y7 and Y7 diluted by 5 times.

2.7 砷含量高的食用菌樣品分析

為了研究微波消解后消解液中砷的形態，選取5個砷含量超過0.4 mg/kg的樣品經微波消解后的消解液過0.45 μm濾膜后，采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(HPLC-ICP-MS)測定其砷形態(色譜條件：Dionex IonPac AS7色譜柱；流動相A相：10 mmol/L碳酸銨；B 相：100 mmol/L碳酸銨；洗脫方式：梯度洗脫)。結果見圖10，樣品編號為Y6和Y8的食用菌樣品消解液中AsB含量高，為主要砷存在形式，樣品編號為Y3、Y7和Y9的食用菌樣品消解液As(V)含量高，為主要砷存在形式。

實驗表明，不同的食用菌樣品經微波消解趕酸后，砷形態仍然復雜，若采用原子熒光光譜法測定該類樣品，不能采用微波消解進行樣品前處理，否則會造成測定結果偏低，特別是編號Y6和Y8食用菌，可能會出現假陰性。而采用石墨爐原子吸收光譜法測定總砷時可以采用微波消解進行樣品前處理，快速準確測定有機砷含量高的食用菌樣品中總砷含量。

圖10 食用菌樣品砷形態色譜圖(a—Y3，b—Y6，c—Y7，d—Y8，e—Y9)Figure 10 Arsenic chromatogram of edible mushrooms samples(a—Y3，b—Y6，c—Y7，d—Y8，e—Y9).

3 結論

采用微波消解-石墨爐原子吸收光譜法測定食用菌中總砷含量。通過優化灰化溫度、原子化溫度、基體改進劑的濃度等條件，與HGAFS相比，該方法在樣品前處理時無需將食用菌樣品中不同砷形態全部轉化為無機砷，大大縮短了食用菌樣品前處理的時間。實驗結果表明，方法具有操作簡便、經濟、準確、可靠等優點，適用于食用菌中總砷含量的測定。但方法線性范圍較窄，對于砷含量高的樣品需稀釋到標準曲線范圍內測定才能保證測定的準確性。