單波長激發-能量色散X射線熒光光譜法檢測蔬菜中多種重金屬元素

石洪瑋 劉曉靜 劉貴巧 徐東輝 毛雪飛

(1.河北工程大學，河北 邯鄲 056038；2.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所/農業農村部農產品質量安全監督檢驗測試中心，北京 100081；3.北京安科慧生科技有限公司，北京 101102；4.中國農業科學院蔬菜花卉研究所/農業農村部蔬菜質量安全控制重點實驗室，北京 100081)

蔬菜是世界各地人民日常飲食的重要部分，是人體通過飲食攝取營養的來源之一[1]。蔬菜中含有豐富人體必需的微量礦物質[2]，例如鋅在人體中有催化、結構構成、參與調節的功能[3]，且對于核酸和蛋白質的合成有極為重要的作用[4]，還有銅和錳等微量必需元素，它們對人體中多種酶的合成有重要的輔助作用[5]。但是蔬菜中除了含有銅、鋅、錳這類微量必需元素外，還有砷、鉛、鎘等有害重金屬元素[6]。例如，砷中毒可能造成的疾病有糖尿病、高血壓、神經退行性疾病等[7]；鎘中毒會導致人體骨質缺乏，造成骨質軟化和骨質疏松癥，如19世紀在日本發生的痛痛病事件[8]。目前實驗室常用的食品中元素檢測的方法有電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)[9-10]、電感耦合等離子體發射光譜法(ICP-OES)[11-12]、石墨爐原子吸收光譜法(GFAAS)[13]、火焰原子吸收光譜法(FAAS)[14]、原子熒光光譜法(AFS)[15]等。上述方法都是準確有效的元素分析方法，也有對應的相關國家標準支持，不過這些方法都需要進行消解才能進行上機測試，消解處理耗時長，且需要強酸、強堿等危險試劑，因此無法實現現場快速檢測。此外，ICP-MS和ICP-OES價格昂貴、運維復雜，而普通AFS、AAS無法多元素同測等問題也限制著上述方法的應用。

X射線熒光光譜法是一種無需消解的、無損的元素檢測方法，特別是能量色散X射線熒光光譜儀(ED-XRF)可以實現小型化和便攜化，常用于材料、礦物、土壤等樣品中高原子序數、mg/kg以上含量水平的元素檢測[16]。由于食品中重金屬元素含量水平較低，常規的ED-XRF較難檢出痕量元素或獲得較好的分析精密度[17]。本研究使用配備曲面彎晶單色化器的ED-XRF，其中全聚焦雙曲面彎晶(DCC)是X射線高分辨率聚焦的關鍵部件，通過對X射線管產生的初級X射線單色化，可以顯著降低X射線譜圖的背景、提高信噪比，進而降低XRF的檢出限[18]。因此，本研究基于單波長激發-能量色散X射線熒光光譜儀(Monochromatic Wavelength Excitation-Energy Dispersive X-ray Fluorescence Spectrometry，MW-EDXRF)，建立蔬菜中As、Pb、Cd、Cr、Ni、Cu、Zn、Rb、Mn等元素的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

MW-EDXRF重金屬分析儀(PHECDA- PRO，北京安科慧生科技有限公司)配備微焦斑X射線管(鎢靶)：滿功率12 W，電壓10～70 kV，電流0～400 μA，高通量硅漂移探測器(SDD)，Fast FP軟件，全聚焦雙曲面彎晶(DCC)。全聚焦型雙曲面彎晶(Johansson-type DCC)能夠對微焦斑X射線管出射的高強特征X射線進行Bragg衍射單色化，并聚焦到直徑數十到數百微米的聚焦面，對樣品中的元素進行單波長激發。

電感耦合等離子體質譜儀(7900型，安捷倫科技有限公司)，微波消解儀(上海屹堯儀器科技發展有限公司)，純水機(Milli-Q Acadeemic，美國)，破壁機(935A，中山市惠人電器有限公司)，研磨儀(RM200，德國Retsch公司)，冷凍干燥機(GOLO-SIM，SIM公司)，壓片機。

1.2 材料與試劑

硼酸(99.5%，上海吉至生化科技有限公司)，硝酸(69.0%±0.9%，國藥集團化學試劑有限公司)，砷、鉛、鎘、鉻、鎳、銅、鋅、銣、錳元素標準儲備液(1 000 mg/kg，國家有色金屬及電子材料分析中心)；圓白菜GBW10014(GBS-5)、柑橘葉GBW10020(GBS-11)、蒜粉GBW10022(GBS-13)、紫菜GBW10023(GBS-14)、胡蘿卜GBW10047(GBS-25)等生物成分分析標準物質(中國地質科學院地球物理地球化學勘查研究所)。

1.3 樣品

本實驗使用的蔬菜樣品包括菠菜、蔥、胡蘿卜、豆角、番茄、姜、空心菜、蓮藕、芹菜、蒜、香菇等均在北京采購。經微波消解ICP-MS法測定，上述蔬菜中As、Pb、Cd、Ni元素含量較低，XRF法無法檢出或穩定檢測，因此本研究根據蔬菜中污染物限量標準GB 2762—2017，采用加標、干燥、均質方法[19]制備了加標樣品，具體方法為：購買來的蔬菜洗凈后，使用無塵布將蔬菜表面水分擦拭干，使用破壁機將蔬菜打漿備用，稱取蔬菜漿200 g加入元素混合標準溶液后攪拌均勻，在-40 ℃冷凍到完全結冰后使用冷凍干燥機在-70 ℃負壓冷凍干燥24 h，冷凍干燥后使用研磨儀研磨、均質，過0.30 mm篩(60目)后置于棕色玻璃瓶備用。

1.4 實驗方法

1.4.1 XRF儀器條件

經優化后，MW-EDXRF重金屬分析儀的條件詳見表1，其中管電壓和管電流的條件由廠家設置。

表1 MW-EDXRF重金屬分析儀條件Table 1 Instrumental conditions of MW-EDXRF

1.4.2 電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)檢測條件

本部分實驗以GB 5009.268—2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》為依據，按照樣品實際情況略作調整。

1.4.2.1 樣品前處理

準備3個微波消解管，分別稱取(0.2±0.000 1) g樣品放置到消解管底部，向消解管中加入3 mL硝酸、2 mL過氧化氫加蓋浸泡過夜預消解，使用微波消解儀進行消解(微波消解升溫程序見表2)。消解完成并冷卻后在加熱板上120 ℃趕酸到消解液剩余1 mL左右，使用容量瓶定容到25 mL。

表2 微波消解升溫程序Table 2 Microwave digestion heating program

1.4.2.2 儀器條件

安捷倫7900型ICP-MS采用常規碰撞模式進行檢測，具體條件如表3所示。

表3 ICP-MS儀器條件與參數設置Table 3 ICP-MS instrumental conditions and parameters

1.4.3 數據分析

本研究中的方差分析部分是使用IBM SPSS Statististics 20進行的單因素方差分析，其中多重比較方法采用最小顯著性差異法(Least Significant Difference)和鄧肯氏新復極差法(Duncan′s New Multiple Range Test)，在95%置信區間下，P值<0.05則認為存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 X射線掃描及熒光信號采集時間

本研究采用基本參數法對MW-EDXRF重金屬分析儀進行定量校準。此時，可以優化的是X射線照射樣品的時間，檢測時間會影響檢測器對X射線激發熒光信號的采集時間、熒光譜圖的擬合時間與基本參數法的迭代次數，因此會影響檢測的精密度和準確度。本實驗利用GBW10022蔬菜基體標準物質，在其他儀器條件確定的情況下進行20～300 s不同照射時間的信號檢測(n=3)。圖1(a)顯示的是XRF輻射時間對檢測結果的相對標準偏差(RSD)的影響，其中Cd、As、Pb、Cr、Ni、Cu元素的RSD在20～200 s隨檢測時間的延長呈顯著的下降趨勢，當超過200 s時RSD均小于15%，基本可以滿足XRF快速篩查的精密度要求；而Rb、Zn、Mn的RSD變化趨勢較為平緩，均在10%以下。圖1(b)顯示的是XRF輻射時間對檢測結果回收率的影響，Cd、Cr在20～300 s范圍內的回收率隨著檢測時間增加逐漸降低，當超過200 s時趨近于100%；As、Pb、Ni、Cu等元素的回收率在檢測時間大于100 s后趨近于100%；Rb、Zn、Mn等元素的回收率隨時間變化不明顯。綜上可知，XRF輻照時間越長，檢測結果精密度(RSD)和準確度(回收率)結果越好。統籌考慮XRF方法精準度和檢測效率，最后將檢測時間定為200 s，9種元素檢測的累積激發時間是600 s。

圖1 檢測時間對XRF檢測結果相對標準偏差(RSD)和回收率的影響(n=3)Figure 1 Effect of XRF radiation time on multi-elemental RSD and recovery in vegetable samples(n=3).

2.2 樣品制備條件

本研究采用硼酸包被固體粉末壓片的制樣方式，需要對壓片時固體樣品粉末的使用量、壓力和壓力保持時間進行優化。粉末樣品壓片后的厚度和密度會影響X射線的輻射效率和熒光密度。當使用XRF進行元素分析時，通常有一個樣品臨界厚度的概念，可能是初級X射線的穿透深度，也可能是特征X射線的穿透深度。如果達不到臨界厚度進行定量分析，會造成儀器分析的精密度下降。在制備粉末壓片樣品時，壓片壓力與壓力保持時間直接影響壓片成品的密度。

2.2.1 壓片樣品量

分別使用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g蒜粉末樣品，采用硼酸包被制樣法，在壓力15 MPa、壓力保持時間60 s的條件下進行3次重復檢測。圖2顯示是樣品量(樣品厚度)對XRF檢測結果的影響。根據方差分析結果，As、Pb、Cd、Cu、Rb、Fe等元素檢測值在稱樣量0.5～2 g范圍內呈逐漸升高趨勢，超過2 g后對檢測值無顯著影響(P>0.05)；Cr、Ni等元素檢測值在0.5～1.5 g范圍內顯著升高，超過1.5 g后對檢測值無顯著影響(P>0.05)；而Mn元素在超過1 g后對檢測值無顯著影響(P>0.05)。綜合上述結果，最后選擇壓片樣品量為2 g。

圖2 壓片樣品量與檢測結果關系圖(n=3)Figure 2 The relationship between sample size and test results(n=3).

2.2.2 壓片壓力

采用硼酸包被的方法，在2 g樣品量，60 s壓力保持時間的條件下分別用10、15、20、25、30、35 MPa的壓力下制備蒜粉樣品壓片，并對檢測結果進行單因素方差分析(圖3)。結果顯示，壓片10～35 MPa對各元素測定值均無顯著性影響(P>0.05)。但是，10 MPa壓片后的樣品易松散，不利于保存，因此最后選擇壓片壓力15 MPa。

圖3 壓片壓力與XRF檢測結果(n=3)Figure 3 Tablet pressure and XRF detection results(n=3).

2.2.3 壓力保持時間

采用硼酸包被方法，在2 g樣品量，15 MPa的條件下分別用30、60、120、150、180 s的壓力保持時間制備蒜粉壓片樣品，并對檢測結果進行單因素方差分析(圖4)。結果顯示，壓片30～180 s對各元素測定值均無顯著性影響(P>0.05)。但是，30 s壓片后的樣品易松散，不利于保存，因此最后選擇2 g樣品量在15 MPa條件下壓片60 s處理。

圖4 壓力保持時間與檢測結果關系圖(n=3)Figure 4 Relationship between tablet pressing time and test results(n=3).

2.3 方法驗證

2.3.1 方法檢出限與定量限

為確定本實驗的方法檢出限與定量限，使用空白纖維素粉末樣品進行11次重復檢測，取測試結果3倍的標準偏差(SD)作為方法檢出限，10倍作為定量限[21]。從表4可以看出，As、Pb、Cd、Cr、Ni、Cu、Zn、Rb、Mn等元素的檢出限(LOD)為0.07～0.32 mg/kg，其中重點關注的有害重金屬As、Pb、Cd的LOD為0.07 mg/kg，能夠滿足食品安全國家標準的污染物限量要求。

表4 MW-EDXRF檢出限與定量限Table 4 Limits of detection and quantification of MW-EDXRF(n=11) /(mg·kg-1)

2.3.2 精密度評價

使用2 g蒜粉在壓片壓力15 MPa，壓力保持時間60 s的條件下制備樣品壓片，進行11次重復檢測，結果見表5。各元素的RSD值在1.0%～10.0%，表明MW-EDXRF測定蔬菜中9種元素的方法有良好的檢測精密度。

表5 MW-EDXRF的檢測精密度Table 5 Precision of MW-EDXRF detection(n=11)

2.3.3 準確度評價

為驗證本實驗檢測方法的準確度，使用MW-EDXRF對5種蔬菜基質的有證標準物質(Certified Reference Materials，CRMs，包括GBW10014、GBW10020、GBW10022、GBW10023、GBW10047)樣品進行測定，并根據CRMs的標定值計算回收率，結果見表6。可以看出，除有個別檢測結果在MW-EDXRF的檢出限附近，顯示未檢出，其他測定值的回收率均在80.0%～119%，并且也都在標準物質的不確定度范圍內。

表6 基體標準物質的MW-EDXRF測定結果Table 6 Elemental presence in vegetable CRM samples by the MW-EDXRF method(n=3)

此外利用本方法測定了11種蔬菜樣品(菠菜、蔥、胡蘿卜、豆角、番茄、姜、空心菜、蓮藕、芹菜、蒜、香菇等)中As、Pb、Cd、Cr、Ni、Cu、Zn、Rb、Mn等元素的含量，與標準方法ICP-MS檢測的結果進行對比，通過線性回歸系數(R2)來分析兩種方法測定結果的符合程度，結果見圖5。可以看出，除Cu的R2為0.983 8，其余8種元素的R2均大于0.99，XRF與ICP-MS標準方法的檢測結果具有較好的一致性，表明新建立的蔬菜中多元素MW-EDXRF法具有良好的檢測準確度。

圖5 XRF與ICP-MS檢測結果回歸曲線Figure 5 Regression curves of XRF and ICP-MS detection results.

3 結論

本研究使用單波長激發能量色散X射線熒光光譜儀建立了蔬菜樣品固體直接分析的重金屬As、Pb、Cd、Cr、Ni、Cu、Zn、Rb、Mn檢測方法。當儀器進樣量為2 g，樣品在15 MPa壓片60 s后，菠菜、蔥、胡蘿卜、豆角、番茄、姜、空心菜、蓮藕、芹菜、蒜、香菇等蔬菜樣品中多元素的LOD為0.07 ～0.32 mg/kg，其中重點關注的有害重金屬As、Pb、Cd的LOD為0.07 mg/kg，能夠滿足食品安全國家標準的污染物限量要求。該方法對蔬菜樣品多次測定的RSD在3.0%～10.0%，回收率在80.0%～119%，具有良好的檢測精密度和準確性。同時，該儀器僅有不到10 kg，不需要樣品消解處理，檢測時間在10 min左右，非常適合蔬菜多種重金屬的現場快速篩查。