長鏈非編碼RNA母系表達基因3、微小RNA-21表達與冠狀動脈鈣化的相關性分析

汪化文，申侖，張紹義，郭淑娟

冠狀動脈鈣化是鈣鹽在冠狀動脈壁上沉積的病理改變［1］。研究表明，鈣化是冠狀動脈粥樣硬化、高血壓等疾病的共同的標志性病理表現［2-3］。鈣化在一定程度上可預示冠心病的發生和嚴重程度，也是病人發生心肌梗死等急性心血管事件的重要預測因素［4］。因此早期篩查冠狀動脈鈣化對預防心血管疾病發生有重要意義。研究認為，炎癥反應增加是冠狀動脈鈣化發生的重要影響因素。有研究表明，長鏈非編碼RNA母系表達基因3（LncRNA MEG3）在動脈粥樣硬化病人血漿中表達下調，與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等炎性因子分泌增加有關，可能通過影響炎癥反應參與疾病進展調節［5］。心肌梗死模型小鼠心肌組織中微小RNA-21（miR-21）表達顯著升高，與單核細胞/巨噬細胞產生的TNF-α、IL-1β等炎性因子表達水平升高密切相關，可調控小鼠心臟功能障礙［6］。由于LncRNA MEG3、miR-21在冠狀動脈鈣化進展中研究較少，且LncRNA MEG3與miR-21在其他疾病中已被證實有相互作用機制［7］，本研究擬通過檢測血清LncRNA MEG3、miR-21表達水平，分析二者與冠狀動脈鈣化發生關系，并探究二者對冠狀動脈鈣化發生的評估價值，以期為臨床早期準確評估冠狀動脈鈣化發生發展提供一定幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年6月至2019年6月在邯鄲市中心醫院行冠狀動脈造影及CT檢查確診為冠狀動脈鈣化病人189例作為研究對象（鈣化組），其中男性104例，女性85例，年齡（61.58±8.13）歲，范圍51～73歲。另選取同期在該院行冠狀動脈造影及CT檢查顯示無冠狀動脈鈣化者183例作為未鈣化組，其中男性94例，女性89例，年齡（60.69±7.82）歲，范圍49～72歲。納入標準：①鈣化組Agatston積分＞0分［8］；②未鈣化組Agatston積分=0［8］；③臨床資料完整。排除標準：①合并患有心肌梗死、嚴重心力衰竭者；②肝、腎功能嚴重不足者；③合并患有感染性疾病、甲狀腺疾病、惡性腫瘤者。本研究獲邯鄲市中心醫院倫理委員會批準（批號20180425），病人或其近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑實時熒光定量PCR（qRTPCR）儀（美國ABI公司，型號7500）、RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司，貨號RP2401）、反轉錄試劑盒（美國Qiangen公司，貨號205311）、qRT-PCR試劑盒（美國Qiangen公司，貨號208152）、TNF-α酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（德國IBL公司，貨號JK-00018）、IL-1β ELISA試劑盒（德國IBL公司，貨號BE45111）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 所有受試者于入院檢查時清晨空腹采集外周靜脈血5 mL，在4℃、3 000 r/min（離心半徑14.5 cm）條件下離心10 min，收集上清液（即血清）于無菌EP管中，在-80℃環境下保存。

1.3.2 一般資料收集 所有受試者于入院檢查時收集年齡、體質量指數（BMI）、血鈣、血磷、血肌酐（SCr）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、高敏C反應蛋白（hs-CRP）等一般資料。

1.3.3 血清LncRNA MEG3、miR-21表達水平檢測 采用qRT-PCR法檢測血清LncRNA MEG3、miR-21表達水平。采用Trizol法提取總RNA后，使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，用于qRTPCR。qRT-PCR 20 μL反應體系如下：cDNA 2 μL，正向、反向引物各2 μL，SYBR?Primix Ex TaqTM10 μL，ROX 0.4 μL，DEPC水3.6 μL。反應步驟如下：95℃、8 min，1個循環；95℃、15 s，62℃、38 s，73℃、15 s，40個循環，一個樣品設置三個重復。采用2-ΔΔCt法計算LncRNA MEG3、miR-21相對表達水平。實驗所用引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 血清TNF-α、IL-1β表達水平檢測 采用ELSIA法檢測血清TNF-α、IL-1β表達水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學方法使用SPSS 19.0軟件對本文中數據進行分析，計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料用例（%）表示，用χ2檢驗；采用Pearson法分析冠狀動脈鈣化病人血清LncRNA MEG3、miR-21表達水平及與HbA1c、hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平相關性；采用logistic回歸模型分析冠狀動脈鈣化發生的影響因素；采用受試者工作特征曲線（ROC）評估血清LncRNA MEG3、miR-21表達水平對冠狀動脈鈣化的預測價值。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鈣化組與未鈣化組一般資料比較鈣化組與未鈣化組年齡、BMI、血鈣、血磷、SCr、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平及性別、糖尿病、高血脂癥比例比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。鈣化組血清HbA1c、hs-CRP水平及冠心病、高血壓比例均明顯高于未鈣化組（P＜0.05）。見表2。

2.2 鈣化組與未鈣化組血清LncRNA MEG3、miR-21、TNF-α、IL-1β表達水平鈣化組病人血清LncRNA MEG3表達水平明顯低于未鈣化組，血清miR-21、TNF-α、IL-1β表達水平明顯高于未鈣化組（P＜0.05），見表3。

表3 冠狀動脈鈣化189例與無冠狀動脈鈣化183例血清LncRNA MEG3、miR-21、TNF-α、IL-1β表達水平比較/

表3 冠狀動脈鈣化189例與無冠狀動脈鈣化183例血清LncRNA MEG3、miR-21、TNF-α、IL-1β表達水平比較/

注：LncRNA MEG3為長鏈非編碼RNA母系表達基因3，miR-21為微小RNA-21，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細胞介素-1β。

組別鈣化組未鈣化組t值P值例數189 183 LncRNA MEG3 0.62±0.17 1.01±0.31 15.11＜0.001 miR-21 2.87±0.93 1.02±0.29 25.73＜0.001 TNF-α/（ng/L）11.72±3.92 9.82±4.13 4.55＜0.001 IL-1β/（ng/L）4.96±0.95 2.32±0.74 29.84＜0.001

2.3 冠狀動脈鈣化病人血清LncRNA MEG3與miR-21表達水平相關性冠狀動脈鈣化病人血清LncRNA MEG3與miR-21表達水平呈負相關（r=-0.32，P＜0.001）。見圖1。

圖1 冠狀動脈鈣化病人血清長鏈非編碼RNA母系表達基因3（LncRNA MEG3）與微小RNA-21（miR-21）表達水平相關性

2.4 冠狀動脈鈣化病人血清LncRNA MEG3、miR-21表達水平與HbA1c、hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平相關性冠狀動脈鈣化病人血清LncRNAMEG3與hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平呈負相關，血清miR-21與hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平呈正相關（P＜0.05），見表4。

表4 冠狀動脈鈣化病人血清LncRNA MEG3、miR-21表達水平與HbA1c、hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平相關性

2.5 冠狀動脈鈣化發生的影響因素分析以本研究資料為樣本，以是否發生冠狀動脈鈣化為因變量（發生=1，未發生=0），以表2，表3中兩組差異有統計學意義（P＜0.05）的冠心病、高血壓及HbA1c、hs-CRP、LncRNA MEG3、miR-21、TNF-α、IL-1β水平等8個指標為自變量建立logistic回歸模型，通過采用方差膨脹因子分析自變量之間的多重共線性分析顯示，本研究所納入的自變量方差膨脹因子均＜10，所以不存在多重共線性，可進行logistic回歸分析。經二元logistic回歸分析顯示，冠心病、LncRNA MEG3水平、miR-21水平是影響冠狀動脈鈣化發生的危險因素（P＜0.05）。見表5。

表2 冠狀動脈鈣化189例與無冠狀動脈鈣化183例一般資料比較

表5 冠狀動脈鈣化發生的影響因素的logistic回歸分析

2.6 血清LncRNA MEG3、miR-21表達水平對冠狀動脈鈣化的預測價值分析血清LncRNA MEG3預測冠狀動脈鈣化的曲線下面積為0.84［95%CI：（0.79，0.87）］，當血清LncRNA MEG3取截斷值0.83時，其診斷靈敏度為78.19%，特異度為87.43%。血清miR-21預測冠狀動脈鈣化的曲線下面積為0.82［95%CI：（0.78，0.86）］，當血清miR-21取截斷值1.81時，其診斷靈敏度為81.48%，特異度為73.77%。血清LncRNA MEG3、miR-21聯合檢測預測冠狀動脈鈣化的曲線下面積為0.88［95%CI：（0.84，0.91）］，靈敏度為84.13%，特異度為85.79%。見圖2。

圖2 血清LncRNA MEG3、miR-21表達水平對冠狀動脈鈣化的預測價值的ROC曲線

3 討論

血管平滑肌細胞表型轉化是血管鈣化發生的重要機制，在炎癥反應刺激下，來源于間充質干細胞的血管平滑肌細胞可轉化為成骨細胞，通過產生骨基質蛋白促進礦化進程并沉積于血管［9］。表明炎癥反應增加和血管平滑肌細胞表型轉化是冠狀動脈鈣化發生的重要影響因素。

LncRNA MEG3是一種長度大于200 nt的長鏈非編碼RNA，已被證實可通過調控相關通路在腫瘤進展中起抑制作用［10］。Bai等［11］研究發現，冠心病病人動脈組織中LncRNA MEG3表達水平下調，過表達LncRNA MEG3可通過抑制血管平滑肌細胞增殖、促進細胞凋亡參與動脈粥樣硬化進展調控。本研究結果顯示，鈣化組病人血清LncRNA MEG3表達水平明顯低于未鈣化組，提示LncRNA MEG3在冠狀動脈鈣化發生時呈低表達，可能與血管平滑肌細胞代謝異常有關。有研究報道，LncRNA MEG3在肺部細菌感染小鼠模型中下調，過表達時可靶向抑制IL-1β等炎性因子表達減緩小鼠的肺部炎癥反應［12］。強直性脊柱炎病人血清中LncRNA MEG3低表達，可靶向TNF-α、IL-1β發揮抗炎作用［13］。本研究中，冠狀動脈鈣化病人血清LncRNA MEG3與hs-CRP、TNF-α、IL-1β 水平呈負相關，提示LncRNA MEG3可能通過調控hs-CRP、TNF-α、IL-1β等炎性因子表達促進炎癥反應進展，進而影響血管平滑肌細胞轉化等促進冠狀動脈鈣化發生。

miR-21是一種短鏈非編碼RNA，在乳腺癌、高血壓腎損害等疾病中具有調控作用［14-15］。有研究發現，miR-21可通過調控血管平滑肌細胞增殖和遷移影響血管內皮功能［16］。Vahed等［17］研究報道，冠脈狹窄病人外周血單個核細胞中miR-21表達水平明顯升高，可能通過影響血管生成、白細胞黏附、炎癥反應等生物學過程促進冠脈疾病的發生和進展。本研究結果顯示，與未鈣化組相比，鈣化組血清miR-21表達水平明顯升高，提示miR-21表達水平上調可能預示冠狀動脈鈣化發生。有研究表明，miR-21可通過調控骨橋蛋白等表達影響血管平滑肌細胞表型轉化，參與動脈粥樣硬化發生發展［18］。推測冠狀動脈鈣化發生時miR-21高表達可能與血管平滑肌細胞表型轉化有關。又有研究表明，miR-21定位于心臟組織中的炎性細胞，是急性心臟損傷大鼠心臟炎癥浸潤的潛在生物標志物［19］。膿毒癥病人外周血中miR-21表達水平升高，可能靶向激活NLRP3等炎性小體分泌TNF-α、IL-1β等炎性因子介導脂多糖誘導的細胞焦亡過程［20-21］。本研究結果顯示，血清miR-21與hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平呈正相關，提示miR-21在冠狀動脈鈣化發生進展中可能通過調節炎癥反應增加誘導血管平滑肌細胞轉化等。

Zhu等［7］研究發現，LncRNA MEG3在肺動脈平滑肌細胞中表達下調，正常或缺氧狀態下抑制MEG3均可通過靶向調控miR-21/PTEN表達促進細胞增殖和遷移。本研究結果顯示，冠狀動脈鈣化病人血清LncRNA MEG3與miR-21表達水平呈負相關，提示LncRNA MEG3在參與冠狀動脈鈣化發生時可能通過影響miR-21表達發揮作用，但具體機制尚需進行進一步驗證。

進一步研究發現，LncRNA MEG3、miR-21水平均是影響冠狀動脈鈣化發生的危險因素，血清LncRNA MEG3、miR-21聯合檢測預測冠狀動脈鈣化的曲線下面積為0.88，靈敏度為84.13%，特異度為85.79%，提示二者對冠狀動脈鈣化發生的預測價值較高，臨床可關注二者變化，以提高冠狀動脈鈣化的早期診出率。

綜上所述，冠狀動脈鈣化病人血清LncRNA MEG3表達水平明顯降低，miR-21表達水平明顯升高，二者可能作為生物標志物，共同預示冠狀動脈鈣化發生。但由于本研究僅從表達層面分析二者在冠狀動脈鈣化中的作用，具體作用機制還需進一步進行動物、細胞等實驗進行驗證。