長鏈非編碼RNA肝癌高表達轉(zhuǎn)錄本通過微小RNA-134-5p促進宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的機制研究

譚建福，饒麗娟，王秀

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，在全世界女性癌癥死亡原因占很大比例。據(jù)報道，全球每年有超過520 000名新增宮頸癌病人，每年因?qū)m頸癌死亡人數(shù)超過270 000［1］。由于巴氏涂片篩查試驗的廣泛實施，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率在過去30年內(nèi)有所下降，但晚期宮頸癌病人的預(yù)后仍較差，5年生存率約為15%［2］。因此，迫切需要深入了解宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制，為確定新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物提供基礎(chǔ)。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一種不具有編碼蛋白質(zhì)能力的RNA，長度＞200個核苷酸，可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在基因表達和細(xì)胞生物學(xué)功能中發(fā)揮作用［3-4］。大量研究表明lncRNAs與包括宮頸癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［5-6］。然而，目前關(guān)于宮頸癌發(fā)病和進展的LncRNAs較匱乏，以往報道顯示，lncRNA肝癌高表達轉(zhuǎn)錄本（highly upregulated in liver cancer，HULC）可促進胃癌、肝癌和骨肉瘤等腫瘤惡性進展，發(fā)揮致癌基因的功能［7-9］。近期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HULC在宮頸癌組織中表達量較高，但其是否參與宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，目前未見相關(guān)報道［10］。目前研究發(fā)現(xiàn)，HULC與下游微小RNA（microRNAs，miRNA）存在作用靶點［11］，本研究前期通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，HULC與miR-134-5p間存在相似結(jié)合位點。miR-134-5p可調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖過程，具有一定抑癌作用。故本研究推測HULC可通過抑制miR-134-5p的表達參與宮頸癌的進展和預(yù)后。因此，本研究于2019年10月至2020年5月，探究HULC和miR-134-5p間的調(diào)控關(guān)系及對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期為宮頸癌的診斷提供潛在的標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料人正常宮頸上皮細(xì)胞Ect1/E6E7及宮頸癌細(xì)胞HeLa、Caski、SiHa、C-33A購自美國ATCC；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；特異性靶向HULC siRNA和非特異性siRNA、miR-134-5p模擬物（miR-134-5p mimics）、模擬物對照（mimics control）、miR-134-5p抑制劑（miR-134-5p inhibitors）、抑制劑物對照（inhibitors control）均購自廣州銳博；Trizol試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR熒光檢測試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。Transwell小室購自美國Coring公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組將宮頸癌C-33A細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放置在體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳、37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，孵育24 h后更換培養(yǎng)基，穩(wěn)定孵育48 h，細(xì)胞貼壁生長匯合度達80%以上時，用胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)增殖期的細(xì)胞進行后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗。將生長狀態(tài)良好的C-33A細(xì)胞接種到96孔板中，繼續(xù)孵育24 h，待細(xì)胞生長匯合約50%時，將特異性HULC siRNA和非特異性siRNA用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至C-33A細(xì)胞中，分別命名為si-HULC組和NC組，以未轉(zhuǎn)染的C-33A細(xì)胞命名為Control組，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放置在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。特異性HULC siRNA序列：正向-5’-CCGGAAUAUUCUUUGUUUAUU-3’；反 向-5’-UAAACAAAGAAUAUUCCGGUU-3’；非 特異性siRNA序列：正向-5’-CCUUAUAUGUUCUGGAAUUUU-3’；反向-5’-UAAAACGAAUGGAAUUCACUU-3’。

1.3 qRT-PCR檢測細(xì)胞中HULC的表達采用Trizol法從正常宮頸上皮細(xì)胞Ect1/E6E7和宮頸癌細(xì)胞HeLa、Caski、SiHa、C-33A中提取RNA，si-HULC組和NC組C-33A細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，同樣以Trizol法提取細(xì)胞中RNA。使用超微量核酸蛋白檢測儀測定RNA的濃度和純度，選取合格的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，通過SYBR Green PCR熒光檢測試劑盒測定細(xì)胞中HULC相對表達水平，以18S rRNA作為內(nèi)部對照，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，采用40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線，得出Ct值，采用2-ΔΔCt公式計算細(xì)胞中HULC相對表達量，實驗重復(fù)3次，取均值。引物：18S rRNA：正向引物5’-AGGATCCATTGGAGGGCAAGT-3’；反向引物5’-TCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCA-3’；HULC正向引物5’-TCATGATGGAATTGGAGCCTT-3’；反向引物5′-CTCTTCCTGGCTTGCAGATTG-3’。

1.4 CCK-8檢測C-33A細(xì)胞的增殖能力將各組C-33A細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，以1×103個/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個平行復(fù)孔，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入20 μL CCK-8，37℃孵育1 h，在酶標(biāo)儀上吸光度值（OD值），波長設(shè)為測定450 nm。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)收集各組C-33A細(xì)胞，以PBS洗滌2次，加入適量1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞至1×106個/毫升，向細(xì)胞懸液中添加5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光反應(yīng)15 min，補加1×Binding Buffer緩沖液，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 Transwell實驗將Transwell小室置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在小室的上室中加入50 μL以不含血清培養(yǎng)基稀釋的Matrigel基質(zhì)膠，待基質(zhì)膠凝固后備用。Transwell小室的下室添加600 μL含15%胎牛血清的培養(yǎng)基，收集各組細(xì)胞計數(shù)，取約1×104個細(xì)胞加入到Transwell小室的上室（侵襲實驗上室基底膜以Matrigel基質(zhì)膠包被，遷移實驗無需Matrigel包被），轉(zhuǎn)移小室于37℃培養(yǎng)箱48 h后取出，拭去上室細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，洗去染色，晾干后在顯微鏡下（隨機選5個視野）觀察并計數(shù)。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炆镄畔W(xué)軟件LncBase Experimental v.2預(yù) 測結(jié)果 顯示，HULC與miR-134-5p存在相似結(jié)合位點，為進一步驗證HULC能夠靶向作用于miR-134-5p，將miR-134-5p與HULC結(jié)合位點的3’UTR擴增并構(gòu)建到熒光素酶報告基因載體上，記為HULC-Wt，并將miR-134-5p與HULC亂序結(jié)合位點的3’UTR構(gòu)建到熒光素酶報告基因載體上，記為HULC-Mut。將HULC-Wt和HULC-Mut與miR-134-5p mimics或mimics control共同轉(zhuǎn)染到C-33A細(xì)胞中，48 h后使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒分析各組細(xì)胞的相對熒光素酶活性。

1.8 轉(zhuǎn)染miR-135-5p inhibitor逆轉(zhuǎn)實驗為進一步驗證HULC靶向miR-134-5p調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，本研究在抑制HULC表達的C-33A細(xì)胞中 轉(zhuǎn)染miR-134-5p inhibitor或inhibitor對照，分別記為si-HULC+anti-NC組和si-HULC+antimiR-134-5p組，采用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-134-5p的表達水平，miR-134-5p正向引物5’-ATCTGTGACTGGTTGACCAGAGG-3’；反 向 引 物5’-TGCAGGGTCCGAGGT-3’；U48正向引物5’-AGTGATGATGACCCCAGGTAACTC-3’；反向引物5′-CTGCGGTGATGGCATCAG-3’。采用CCK-8檢測、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell實驗分析細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力，步驟同上。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，以上實驗均重復(fù)3次，取均值，計量資料以表示，兩組采用t檢驗分析相對熒光素酶活性，多組采用單因素方差分析HULC的表達量、細(xì)胞活力、凋亡率，以及侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)，多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗的方法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HULC在宮頸癌細(xì)胞中呈高表達qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與Ect1/E6E7細(xì)胞1.00±0.11相比，C-33A、Caski、SiHa、HeLa細(xì) 胞 中HULC的 表 達 量（3.49±0.40、2.26±0.21、1.77±0.19、1.95±0.24）明顯升高（F=39.92，P＜0.001），在各宮頸癌細(xì)胞系中，C-33A細(xì)胞中HULC的表達量最高（P＜0.05），因此選取C-33A細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

2.2 抑制HULC的表達對C-33A細(xì)胞增殖和凋亡的影響qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染HULC siRNA 48 h后C-33A細(xì)胞中HULC的表達量，結(jié)果顯示，與Control組和NC組比較，si-HULC組細(xì)胞中HULC的表達量明顯下調(diào)（P＜0.05）；Control組和NC組間相比，HULC的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖能力，與Control組和NC組比較，si-HULC組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與Control組和NC組比較，si-HULC組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；Control組和NC組間相比，細(xì)胞OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1，圖1。

表1 各組C-33A細(xì)胞中HULC的表達量、細(xì)胞活力和凋亡率比較/

表1 各組C-33A細(xì)胞中HULC的表達量、細(xì)胞活力和凋亡率比較/

注：HULC為肝癌高表達轉(zhuǎn)錄本，OD為光密度。①與Control組比，P＜0.05。②與NC組比，P＜0.05。

組別Control NC si-HULC F值P值重復(fù)次數(shù)333 HULC 1.01±0.10 0.94±0.08 0.18±0.02①②113.52＜0.001 OD值0.64±0.11 0.59±0.08 0.38±0.05①②8.16 0.019凋亡率/%2.88±0.30 3.01±0.34 18.54±2.16①②147.79＜0.001

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

2.3 抑制HULC的表達對C-33A細(xì)胞侵襲和遷移的影響Transwell實驗結(jié)果顯示，見圖2，表2。si-HULC組侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)顯著少于Control組和NC組（P＜0.05）。

表2 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力/

表2 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力/

注：Control為對照，NC為非特異性siRNA，si-HULC為特異性HULC siRNA。①與Control組比，P＜0.05。②與NC組比，P＜0.05。

組別Control NC si-HULC F值P值重復(fù)次數(shù)333侵襲細(xì)胞數(shù)120.15±16.24 112.54±13.86 46.28±10.16①②26.58 0.001遷移細(xì)胞數(shù)176.33±20.04 158.65±18.66 78.18±10.80①②28.43 0.001

2.4 HULC抑制miR-134-5p的表達在線軟件LncBase Experimental v.2預(yù)測 結(jié)果 顯示，HULC和miR-134-5p有靶向結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，在HULC-Wt組中，轉(zhuǎn)染miR-134-5p mimics的細(xì)胞相對熒光度酶活性明顯低于miRNC組（P＜0.05）；在HULC-Mut組中，兩組細(xì)胞相對熒光度酶活性無明顯改變（P＜0.05）。為進一步驗證HULC對miR-134-5p表達的負(fù)向調(diào)控作用，本研究qRT-PCR檢測抑制HULC的表達后對miR-134-5p表達的影響，結(jié)果顯示，與NC組（1.00±0.09）相比，si-HULC組細(xì)胞中miR-134-5p表達（2.45±0.24）顯著升高（t=16.37，P＜0.05）。見圖3，表3。

表3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測HULC和miR-134-5p的相互作用/

表3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測HULC和miR-134-5p的相互作用/

注：miR-NC為模擬物對照，miR-134-5p為miR-134-5p模擬物，HULC-Wt為HULC野生型載體，HULC-Mut為HULC突變型載體。

組別miR-NC miR-134-5p t值P值重復(fù)次數(shù)。33 HULC-Wt 1.00±0.10 0.23±0.02 22.65＜0.001 HULC-Mut 1.00±0.09 0.99±0.09 0.24 0.817

圖3 在線軟件LncBase Experimental v.2預(yù)測HULC和miR-134-5p結(jié)合位點

2.5 抑制miR-134-5p的表達對C-33A細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與si-HULC組 和si-HULC+anti-NC組 比，si-HULC+anti-miR-134-5p組 細(xì) 胞 中miR-134-5p的 表達水平明顯降低（P＜0.05）。CCK-8實驗結(jié)果顯示，與si-HULC組和si-HULC+anti-NC組比，si-HULC+anti-miR-134-5p組細(xì)胞OD值顯著升高（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與si-HULC組和si-HULC+anti-NC組比，si-HULC+anti-miR-134-5p組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。Transwell實驗結(jié)果顯示，與si-HULC組 和si-HULC+anti-NC組 比，si-HULC+anti-miR-134-5p組侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均明顯增多（P＜0.05）。si-HULC組和si-HULC+anti-NC組相比，以上各指標(biāo)均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4，5；表4。

表4 抑制miR-134-5p對C-33A細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響/

表4 抑制miR-134-5p對C-33A細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響/

注：si-HULC為特異性HULC siRNA，si-HULC+anti-NC為特異性HULC siRNA+抑制劑對照，si-HULC+anti-miR-134-5p為特異性HULC siRNA+miR-134-5p抑制劑，OD為光密度。①與si-HULC組比，P＜0.05。②與si-HULC+anti-NC組比，P＜0.05。

組別si-HULC si-HULC+anti-NC si-HULC+anti-miR-134-5p F值P值重復(fù)次數(shù)333 miR-134-5p 1.00±0.10 0.99±0.11 0.18±0.02①②88.57＜0.001 OD值0.39±0.05 0.41±0.04 0.61±0.06①②17.30 0.003凋亡率18.14±2.25 19.22±2.43 8.27±1.14①②26.72 0.001侵襲細(xì)胞數(shù)48.02±10.04 47.96±8.64 96.28±12.12①②21.70 0.002遷移細(xì)胞數(shù)80.20±9.24 82.36±10.58 156.82±16.15①②37.39＜0.001

圖4 抑制miR-134-5p的表達對C-33A細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

宮頸癌是全球常見的婦科惡性腫瘤之一，也是全世界女性癌癥死亡的主要原因［12］。探索宮頸癌發(fā)生的分子機制有利于開發(fā)宮頸癌的新療法。本研究首次探討了lncRNA HULC和miR-134-5p在宮頸癌中的表達模式和生物學(xué)功能。越來越多的證據(jù)表明，LncRNA可以在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因，參與機體多種生長發(fā)育和病理過程［13-14］。多項研究表明，lncRNA可作為致癌基因或抑癌基因參與腫瘤發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后和診斷［15-16］。在先前的研究中，發(fā)現(xiàn)HULC表達上調(diào)參與調(diào)控肝癌、胃癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移［17-19］。以往研究結(jié)果表明，HULC可能在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要功能。近期發(fā)現(xiàn)HULC在宮頸癌中表達亦呈高表達，且與病人預(yù)后不良密切相關(guān)［10］。但關(guān)于HULC與宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的研究鮮有報道，因此，本研究旨在探究HULC對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及分子機制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HULC在宮頸癌細(xì)胞中的表達顯著高于人正常宮頸上皮細(xì)胞Ect1/E6E7。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，在宮頸癌C-33A細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HULC siRNA后HULC的表達顯著下調(diào)，提示轉(zhuǎn)染HULC siRNA可有效抑制HULC的表達。此外本研究發(fā)現(xiàn)，抑制HULC的表達后C-33A細(xì)胞OD值降低，凋亡率升高，侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)減少，表明抑制HULC的表達可抑制宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，推測HULC對宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用。

lncRNA在人類疾病中的重要性可能與它們通過各種機制影響細(xì)胞功能的能力有關(guān)［20-21］。受到“競爭性內(nèi)源RNA”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的啟發(fā)，假設(shè)HULC也可作為ceRNA，因此需尋找與HULC相互作用的潛在的miRNA。為支持這一觀點，本研究采用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測與HULC相互作用的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-134-5p與HULC可形成互補堿基配對。此外通過雙熒光素酶報告基因驗證了HULC與miR-134-5p相互作用。qRT-PCR檢測結(jié)果進一步驗證了HULC可負(fù)向調(diào)控miR-134-5p的表達。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-134-5p可通過靶向整合素β1抑制非小細(xì)胞肺癌A549和H1299細(xì)胞的侵襲和遷移［22］。湯繼英等［23］研究發(fā)現(xiàn)，miR-134-5p的過表達不僅可以抑制人宮頸癌細(xì)胞體外增殖和細(xì)胞周期進程，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)合本研究結(jié)果提示，抑制HULC的表達抑制宮頸癌C-33A細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移與上調(diào)miR-134-5p的表達有關(guān)。為進一步驗證該結(jié)論，本研究在抑制HULC表達的C-33A細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-134-5p抑制物，檢測發(fā)現(xiàn)，抑制miR-134-5p的表達后可逆轉(zhuǎn)HULC表達下調(diào)導(dǎo)致的C-33A細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，逆轉(zhuǎn)HULC表達下調(diào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明HULC靶向調(diào)控miR-134-5p參與宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。

綜上所述，本研究證明HULC在宮頸癌組織和細(xì)胞中表達上調(diào)，體外抑制宮頸癌C-33A細(xì)胞中HULC的表達可抑制細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力，其作用機制可能與上調(diào)miR-134-5p的表達有關(guān)。關(guān)于miR-134-5p調(diào)控下游靶基因的研究本實驗暫未涉及，后續(xù)研究將進一步探究。隨著HULC的深入研究，其可能成為宮頸癌的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點。