腎上腺靜脈取血聯合高效液相色譜-串聯質譜法分析腎上腺激素代謝譜在原發性雙側腎上腺大結節增生診斷中的應用

李楠，張倩，楊國慶，呂朝暉，裴育，李春霖，謝雯春，王凱

原發性雙側腎上腺大結節增生（primary bilateral marconodular adrenal hyperplasia，PBMAH）是一種罕見的庫欣綜合征亞型，所占比例不足1%［1］。其臨床表現多不典型，生化特征表現為血促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）水平低或正常、皮質醇不完全或不被地塞米松抑制、24 h尿游離皮質醇升高或正常，影像學表現為雙側腎上腺結節樣增生改變。學術界在很長一段時間認為該病為ACTH非依賴性，命名為“ACTH非依賴性大結節樣腎上腺增生”（ACTH-independent marconodular adrenal hyperplasia，AIMAH）。但隨著對其發病機制的深入研究，證實PBMAH病人腎上腺皮質細胞簇通過旁分泌和自分泌的方式表達產生ACTH刺激皮質醇分泌［2］，“非ACTH依賴性”的說法不太妥當，而PBMAH更合適。雖然PBMAH發病機制至今尚未完全闡明，但目前研究發現腎上腺皮質細胞異常表達的多樣化激素受體參與了該病皮質醇分泌的調控［3］。

在過去的十幾年里，高效液相色譜-串聯質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）用于測定類固醇激素促進了腎上腺皮質疾病的研究［4］。與免疫法相比，HPLC-MS/MS不僅特異性、敏感性更好，而且一次可以檢測多種物質［5］。本研究應用腎上腺靜脈取血（adrenal vein sampling，AVS）聯合HPLC-MS/MS的方法對一例雙側腎上腺占位擬診PBMAH的病人行腎上腺激素水平測定分析，探討該方法在PBMAH的診斷和發病機制探討中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料男，59歲，因“發現血壓高10年，雙側腎上腺占位1年半”于2019年7月收入解放軍總醫院第一醫學中心內分泌科住院，血壓119/78 mmHg，體質量指數（BMI）22.4 kg/m2，無滿月臉、水牛背、向心性肥胖，無皮膚菲薄、瘀斑或寬大紫紋等典型庫欣體貌。化驗提示肝、腎功能、甲狀腺功能均正常，血鉀3.99 mmol/L，睪酮8.9 nmol/L，雌二醇132.21 pmol/L，黃體生成素6.03 U/L，泌乳素5.71 μg/L，卵 泡 刺 激 素13.68 U/L，孕 酮0.8 nmol/L。 血ACTH-皮質醇節律及地塞米松抑制試驗結果如表1所示。

表1 ACTH-皮質醇節律及地塞米松抑制試驗情況

血皮質醇368.69 nmol/L，ACTH＜1.1 pmol/L，對照日24 h尿游離皮質醇（urinary free cortisol，UFC）303.5 nmol。小劑量地塞米松抑制試驗服藥后24 h UFC為180.8 nmol，大劑量地塞米松抑制試驗服藥后24 h UFC 182.2 nmol/L。腎上腺CT提示雙側腎上腺區可見多個類圓形結節影，邊緣光滑，密度均一，增強后病灶呈中度均勻強化，最大直徑2.1 cm。見圖1。

圖1 腎上腺CT圖像

受試者按照自愿參加的原則，病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 腎上腺取血結果判定方法空腹10 h，晨7～10時在局麻下行雙側腎上腺靜脈取血。術中經雙側股靜脈入路，分別取雙側外周靜脈（股靜脈）、腎上腺靜脈血各兩管，每管6 mL，冰浴立即送檢，一份測定血ACTH、游離皮質醇（free cortisol，F）（化學發光法）和醛固酮（放射免疫法）。計算雙側腎上腺靜脈與外周靜脈血F的比值（腎上腺靜脈血F/股靜脈血F）及雙側腎上腺靜脈的血F與醛固酮的比值比［（腎上腺靜脈血F/同側腎上腺靜脈血醛固酮）（/對側腎上腺靜脈血F/對側腎上腺靜脈血醛固酮）］，按照梅奧診所的標準，腎上腺靜脈與外周靜脈血F比值大于6.5提示皮質醇分泌腺瘤，雙側腎上腺靜脈血F與醛固酮的比值比大于2.3為單側功能腺瘤的診斷閾值［6］。另一份采用HPLC-MS/MS行腎上腺激素代謝譜測定，分析腎上腺局部與外周血的代謝譜情況。

1.3 HPLC-MS/MS材料和方法

1.3.1 主要試劑 包括孕烯醇酮、孕酮、17-α-羥孕酮、皮質醇、可的松、睪酮、二氫睪酮、脫氧皮質酮、雄烯二酮、脫氫異雄酮、皮質酮、11-脫氧皮質醇、醛固酮、雌酮、雌二醇、雌三醇、17-α-羥孕烯醇酮、脫氫異雄酮硫酸鹽的標準品混合液（除脫氫異雄酮濃度范圍為1～30 000 μg/L以外，其余激素濃度范圍為0.01～300.00 μg/L），內標混標工作液（濃度：10 μg/L），質譜級甲醇，純凈水。

1.3.2 樣本及標品前處理方法 使用移液器量取200 μL樣本或標品溶液于1.5 mL離心管中，加入50 μL內標混標工作液和400 μL沉淀液。將溶液充分混勻并于14 000 r/min條件下離心10 min，離心后收集上清液備用。使用固相萃取柱（Oasis PRiME HLB uElution plate）進一步純化樣本，分別用200 μL甲醇和200 μL水活化固相萃取柱，將上清液及磷酸溶液混勻后上樣，隨后用200 μL甲醇溶液進行清洗，30 μL甲醇進行洗脫，最后加入70 μL水于洗脫液中并混勻，上機檢測。

1.3.3 液質方法 島津液相色譜儀LC-20ADXR和AB Sciex QTRAP 5500三重四極桿質譜儀進行聯用，選用Turbo-V電噴霧離子源。色譜柱為Waters C18色譜柱，柱子的長度為100 mm，內徑為2.1 mm.流動相分別為含有氟化銨的水相（A相）和甲醇（B相）。色譜梯度由40%甲醇升至85%甲醇，隨后使用100%甲醇沖洗3 min。總流速為0.45 mL/min。選擇正離子及負離子模式，進行多反應監測方式掃描待測物，離子化電壓4 500 V，源溫度700℃。

使用Analyst軟件對數據進行采集和處理。

2 結果

腎上腺靜脈取血結果如表2所示，左側腎上腺與外周血F比值3.46，右側腎上腺與外周血F比值2.99，兩側經醛固酮校正后的F比值比為1.35（左/右），提示雙側無明顯差異。ACTH在雙側腎上腺局部均高于外周血，左側腎上腺靜脈與股靜脈ACTH比值為1.34，右側腎上腺與股靜脈ACTH比值為1.41。

表2 患者雙側腎上腺靜脈取血測定的激素情況

質譜分析代謝譜測定結果如表3所示，股靜脈血的類固醇激素代謝產物無明顯的升高。而腎上腺局部取血的類固醇激素水平有不同程度的升高表現，醛固酮、可的松、雌二醇等激素水平處于正常范圍，但相應的前體物質皮質酮、皮質醇、雌酮均升高。

表3 腎上腺取血HPLC-MS/MS分析腎上腺激素代謝譜情況

圖2所示為右側腎上腺質譜分析結果，可見腎上腺皮質激素代謝均處于激活狀態，鹽皮質激素、糖皮質激素、性腺激素都有不同程度的升高。

圖2 右腎上腺質譜分析代謝譜

經AVS證實病人為PBMAH所致的亞臨床庫欣綜合征，雙側腎上腺皮質分泌差異不明顯，因皮質醇水平升高不明顯，臨床癥狀不顯著，病人要求繼續觀察。口服藥物控制血壓，監測血糖、血脂、骨代謝情況，定期復查腎上腺CT，評估腎上腺功能。半年后隨訪，病人病情平穩，血壓波動在120～135/75～89 mmHg，生化提示血糖5.7 mmol/L，鉀4.16 mmol/L，低密度脂蛋白膽固醇2.62 mmol/L。

3 討論

PBMAH病人的診斷需要全面系統的影像學表現評估和內分泌學研究。因病人常不具備典型庫欣綜合征表現，常常以影像學檢查發現的腎上腺意外瘤就診。生化檢查異常包括血、尿皮質醇水平升高，皮質醇晝夜分泌戒律消失，ACTH正常或偏低，小劑量及大劑量地塞米松抑制試驗不能被抑制［7］。影像學檢查中，PBMAH以良性、雙側腎上腺增生性和大結節樣改變為特征，腎上腺可能有明顯的增大。但是目前影像學手段，如CT或者磁共振不能區分腎上腺占位是否有功能。18F-PET/CT作為功能影像學方法，在腎上腺皮質醇瘤的檢測敏感性50%，特異性81.8%［8］，且功能與非功能腫瘤之間的SUV值有很大的重疊，限制了該檢查的辨識能力。

PBMAH病人的術后病理學組織檢查是明確診斷的進一步手段。PBMAH病人的腎上腺組織存在一個或多個大結節，直徑一般大于0.4 cm，結節由富含脂質的透明細胞和不含脂質的致密細胞組成，外觀上呈黃色大結節，似“生姜樣”改變。透明細胞主要表達3-β類固醇脫氫酶，透明細胞來自腎上腺束狀帶，每個細胞產生的皮質醇量很少。致密細胞主要表達17-α羥化酶［9］。這些酶學和代謝產物的細微變化在亞臨床階段的外周血檢測中可能很難發現，腎上腺局部取血陽性發現的可能更大，這就促進了AVS在疾病診斷中的應用。治療方面，雙側腎上腺切除被認為最為有效的方法，但是術后病人永久性腎上腺功能減退和可能增加的死亡率是臨床醫生始終面臨的巨大挑戰［10］。因此，在AVS基礎上行單側腎上腺切除是目前臨床上可用的方法［10］。AVS可以區分雙側腎上腺占位是否存在優勢側，是決定手術方案的重要手段［11］。另外，隨著PBMAH腎上腺皮質異常受體被發現，PBMAH受體靶向治療已成為一種可能的治療手段，但仍需要進一步研究［12-13］。

目前臨床上激素檢測的方法為免疫分析方法，包括放射免疫法、化學發光免疫分析法、電化學發光法等。免疫法檢測快、成本低，但是特異性差，容易出現交叉反應，而且一次只能檢測一種類固醇激素［14］，因此，在復雜內分泌疾病的診斷和研究中有一定的局限性。HPLC-MS/MS能夠同時分析樣品中的多個研究目標。在過去的十幾年中，HPLC-MS/MS技術在藥物監測、新生兒篩查、毒理學診斷等臨床領域廣泛應用，是一種可靠的標準技術［15-16］。HPLC-MS/MS方法不但靈敏度、特異度高，還可以同時檢測多種結構類似但分子量不同的物質，檢測動態范圍寬，可對濃度范圍分布非常廣的多種激素進行可靠檢測，適用于內分泌疾病中復雜激素譜的定量檢測［4］。既往內分泌疾病的研究中，HPLC-MS/MS的應用擴大了可測量的激素譜，對腎上腺疾病（如原發性醛固酮、庫欣綜合征等）特征的描述和診斷方面具有較好的價值和應用前景［4］。一項84例庫欣綜合征病人的研究顯示，HPLC-MS/MS測定的激素譜對庫欣綜合征的診斷準確率為87%，特異性89%，在區分不同亞型的庫欣綜合征時具有良好的準確性，總的錯誤分類率為9.5%，這個效力與所有的傳統分類方法相結合的效力相似［17-19］。與ACTH依賴性庫欣綜合征病人相比，腎上腺庫欣綜合征病人HPLC-MS/MS測定的激素譜表現出更低水平的雄激素前體和較高水平的11-脫氧皮質酮。

本研究應用AVS聯合HPLC-MS/MS的方法測定一例雙側腎上腺占位病人腎上腺局部和外周血中激素水平，結果可見腎上腺局部ACTH和皮質醇均高于外周血，雙側無明顯差異。結合病人實驗室檢查、腎上腺影像學表現和AVS結果，PBMAH診斷明確，且雙側腎上腺皮質醇分泌差異不大。與文獻報道類似［17］，本例病人HPLC-MS/MS激素代謝譜中，腎上腺局部的皮質酮、脫氧皮質酮、11-脫氧皮質酮水平升高，而睪酮水平下降，符合腎上腺源性庫欣綜合征的特點。病人雙側腎上腺局部的皮質醇、皮質酮、17α羥孕烯醇酮等水平均高于正常水平，而外周血中激素水平正常。HPLC-MS/MS的結果在進一步證明了AVS結果正確的同時，在病因上有一定的解釋。既往認為PBMAH為ACTH非依賴性，但研究發現病人腎上腺皮質阿皮黑素表達增加且局部可以生成ACTH［2］，同時腎上腺皮質存在異位激素受體（如腸抑胃肽受體、β腎上腺素能受體、5-羥色胺受體等）或受體表達增加（如促黃體生成素受體、絨毛膜促性腺激素受體等），這些使得PBMAH病人腎上腺局部形成了一個重要的旁分泌、自分泌調控系統［3］。本研究的結果很直觀地證實了PBMAH病人腎上腺局部ACTH和類固醇激素分泌的增加，也間接證實了腎上腺皮質旁分泌、自分泌系統的存在。

因此，本研究通過AVS聯合HPLC-MS/MS的方法測定一例雙側腎上腺占位病人腎上腺局部和外周血中激素水平，明確了PBMAH的診斷，并對該病的病因學研究有一定的幫助。AVS聯合HPLC-MS/MS可以很好地體現局部和周圍血腎上腺激素代謝譜的情況，有可能成為PBMAH臨床診斷和治療決策的重要手段之一。