血清氧化應激/抗氧化產物水平與腦梗死患者I型復雜性局部疼痛綜合征嚴重程度的相關性研究

張真真，尹蓮君，許望純，楊加順，陳俊琦，趙遠闖

復雜區域疼痛綜合征（complex regional pain syndrome,CRPS）是一種慢性神經系統疾病，可導致嚴重的功能軀體障礙。其臨床特征為自發性疼痛、痛覺過敏、腫脹、血管舒縮不穩定、運動功能受損和自主神經異常[1-2]。CRPS通常發生在一些傷害性事件后，如創傷、手術、心肌梗死或腦卒中等，少數無特殊病因[3-4]。

CRPS可分為兩種類型：I型，發生時沒有明確的癥狀神經損傷;II型，患者存在可確定的神經損傷[5]。雖然CRPS I型的發病率通常低于II型，但CRPS I型在中風患者中更為常見[6]。CRPSI是一種致殘性神經性疼痛綜合征，其特征為自發或外界刺激誘發疼痛、水腫、血管舒縮和發汗異常、運動功能障礙和營養變化[7]，然而CRPSI并沒有外周神經損傷的明確證據。目前有研究表明炎癥、交感神經活性改變、缺血、再灌注損傷和中樞敏化等機制參與，但CRPSI的潛在機制尚不清楚[8]。

氧化應激是由自由基在體內產生的一種負面作用,是指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態，導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物。對組織損傷、神經源性炎癥、缺血和再灌注損傷的過度炎癥反應都會導致自由基的過度產生[9]。而自由基可進一步增加血管通透性，釋放P物質等神經肽，增強炎癥反應并導致進一步的組織損傷[10]。然而，自由基在CRPSI發病中的作用未有研究。

本研究的科學假設為：CRPSI患者體內自由基的產生增加，而使用抗氧化劑和自由基清除劑作為CRPSI有效治療方法，且血清氧化應激產物濃度的變化可作為一種診斷監測手段。因此本研究擬測量腦梗死CRPSI患者、非CRPSI患者和健康志愿者的血清脂質過氧化產物-丙二醛（Malonaldehyde,MDA）和抗氧化劑超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的表達，并探討其與CRPSI患者癥狀嚴重程度的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2019年8月-2021年8月在南方醫科大學第三附屬醫院住院并診斷為腦梗死后CRPSI的患者75例及非CRPS1患者80例納入本次研究，同時入選同期來自于我院的常規健康體檢者78例。分為三組，即腦梗死后CRPSI患者組(n=75)，腦梗死后非CRPSI患者組(n=80)以及健康對照組(n=78)。所有患者在性別、年齡和BMI中無統計學差異。腦梗死診斷符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[11]相關診斷,且經腦CT或MRI證實。患者均于腦梗死發病后的1～3個月內發生。排除腦出血、腦腫瘤、癲癇、顱內感染、帕金森病等神經系統疾病者；肩周炎、肩關節脫位、腕管綜合征、視力障礙者；伴有嚴重心、肝、腎等臟器功能障礙者。CRPSI的診斷參考Bruehl標準[12]以及下列評估方式：①一般情況資料:出現疼痛的情況和時間點；②患肢皮膚、毛發或指甲的溫度及顏色變化、發汗異常、腫脹及運動功能障礙等；③VAS評分；④運動能力和運動范圍情況；⑤是否存在痛覺異常和痛覺過敏；⑥表面溫度計測量皮膚溫度的情況。有任何其他無關醫療問題的患者都被排除在研究之外。研究方案經我院醫學倫理委員會批準(倫理編號：20190012)，并獲得每位參與者的書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 觀察指標(1)采用VAS評分量表對24 h內患者所感受到的最大疼痛強度進行測量，每位患者用“0”（無痛）到“10”cm（可想象的最嚴重疼痛）的活動來表示他們感知的靜息痛、夜間痛和疼痛強度[13]。(2)水腫分級參考標診斷[14]中的內容：肢體無水腫為0度；有水腫，但皮紋尚清晰為Ⅰ度；有明顯水腫，皮紋不清晰為Ⅱ度；皮紋消失，可見張力性水皰為Ⅲ度。(3)Constant-Murley肩關節功能評分、Carroll手功能評分、Cooney腕關節評分評估患者肩關節、腕關節、手功能情況,其中Constant-Murley肩關節功能評分包括疼痛、日常生活活動、主動活動范圍、肌力4個部分,評分范圍為0～100分，分值越高表示肩關節功能越好[15]。Carroll手功能評分包括抓握、握、側捏、捏、放置、旋前或旋后6項內容,評分范圍為0～38分,分值越高表示手功能越好[15]；Cooney腕關節評分包括疼痛、功能、活動度、背伸/掌屈、握力與正常一側比，評分范圍為0～100分,分值越高表示腕關節功能越好[15]。(4)肢運動功能情況,本研究選擇上肢功能作為研究重點，采用腦卒中患者專用的Brunnstrom運動功能分級標準進行評定，具體分級標準：Ⅰ級為無任何運動；II級為僅出現協同運動模式；III級為可隨意發起協同運動；IV級為共同運動模式打破,開始出現分離運動；V級為肌張力逐漸恢復,有分離精細運動；VI級為運動接近正常水平[16]。

1.2.2 實驗室檢測在早晨禁食至少1 h后收集血清樣本。對于血清樣品，將21號套管插入未患肢的肘前靜脈中。抽取10 mL血液，立即轉移到裝有EDTA的試管中，該試管在8℃下保持1 h，然后在4℃下以3000 rpm離心7 min。將血清轉移到聚丙烯試管中，-20°C下儲存。使用Bioxytech S.A.(Cedex法國）公司的GSH-400和SOD-525方法和分析條件，通過分光光度計（Bio Rad，CA，美國）測量血清SOD水平，使用Randox-RANSOD酶試劑盒和自動分析儀在505 nm和37℃下測量SOD活性。SOD試劑盒批內變異系數為2.5%，批間變異系數為4.7%。使用硫代巴比妥酸反應物法測定血清MDA水平[17]。將樣品放置在96孔板中，并使用微孔板分光光度計讀數器（Bio Rad，CA，美國）在535 nm處讀數。MDA試劑盒批內變異系數為1.3%，批間變異系數為3.1%。

1.3 統計學處理所得數據應用Graphpad8.0 prism統計軟件進行分析。采用Shapiro-Wilktest進行正太分布檢驗。計量資料呈正態分布，以均數±標準差（）表示,兩組資料比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)；計數資料以率或者構成比表示,數據處理采用χ2檢驗,等級資料比較采用非參數的秩和檢驗,采用Spearman或Pearson檢驗進行相關性分析，采用Logistic回歸分析用于確定血清MDA和SOD是否分別是CRPSI患者VAS評分的獨立預測因子，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料腦卒中后CRPSI患者，非CRPSI患者和健康對照組在年齡，性別以及BMI上無統計學差異（P＞0.05，表1）。CRPSI患者Carroll手功能評分和Cooney腕關節評分顯著低于非CRPSI患者(Carroll手功能評分:18.9±5.3vs 20.6±4.4,t=1.564,P=0.042;Cooney腕關節評分:70.0±6.6 vs 72.3±5.8,t=1.476,P=0.038)。血清MDA在腦卒中伴有CRPSI患者中水平顯著高于無CRPSI患者及健康志愿者(2.78±0.62 nmol/mL vs 2.00±0.52 nmol/mL，t=8.437,P＜0.001；2.78±0.62 nmol/mL vs 1.70±0.49 nmol/ml,t=10.122，P＜0.001)（圖1A）。而SOD水平在CRPSI患者中水平則顯著低于CRPSI患者及健康志愿者(82.76±21.80 U/mL vs 153.1±44.73 U/mL,t=12.31，P＜0.001；82.76±21.80 U/mL vs 182.00±63.18 U/mL,t=15.15，P＜0.001)（圖1B）。

表1 腦卒中后CRPSI患者，非CRPSI患者和健康對照組的一般資料比較

圖1 血清MDA和SOD水平在CRPSI患者、非CRPSI及健康對照組中的比較

2.2 血清MDA和SOD水平與疼痛的相關性血清MDA水平在重度疼痛的CPRSI患者中高于輕中度疼痛的患者(3.23±0.49 nmol/mL vs 2.57±0.56 nmol/mL，t=4.973，P＜0.001)（圖2A），而血清SOD水平在重度疼痛的CPRSI患者中低于輕中度疼痛的患者(72.16±20.17 U/mL vs 87.47±21.10 U/mL，t=2.857，P=0.005)（圖2B）。CPRSI患 者 血 清MDA水 平與VAS評 分 呈 正 相 關 性(r=0.610，P＜0.001)（圖2C）,而血清SOD水平與VAS評分呈顯著負相關性(r=-0.342，P=0.005)（圖2D）。ROC曲線分析表明CPRSI患者血清MDA水平的升高(AUC=0.892，P＜0.001)（圖2E）以及SOD水平的降低(AUC=0.701,P=0.005)(圖2F)對CPRSI患者疼痛評定均有較好的診斷價值。此外Logistic回歸分析表明血清MDA和SOD水平均可以作為預測CRPSI患者疼痛的獨立因子（表2）。

表2 Logistic回歸分析

圖2 血清MDA和SOD水平與疼痛的相關性

2.3 血清MDA和SOD水平與肩、手、腕功能的相關性血清MDA水平與Constant-Murley評分(r=-0.626，P＜0.001)（圖3A）、Carroll評分(r=-0.521，P＜0.005)（圖3B）和Cooney評分(P=-0.322，P=0.005)（圖3C）均呈負相關，而血清SOD水平與Constant-Murley評分(r=0.447，P＜0.001)（圖3D）和Carroll評分(r=0.465，P＜0.001)（圖3E）呈正相關，但與Cooney評分的相關性無統計學意義(r=0.128,P=0.285)（圖3F）。A.血清MDA水平與Costant-Murley評分的相關性；B.血清MDA水平與Carroll評分的相關性；C.血清MDA水平與Cooney評分的相關性；D.血清MDA水平與Carroll評分的相關性；E.血清MDA水平與Carroll評分的相關性F.血清MDA水平與Cooney評分的相關性

圖3 血清MDA和SOD水平與肩、手、腕功能的相關性

2.4 血清MDA和SOD水平在不同肢體水腫分度和Brunnstrom分級中的表達I度水腫患者30例，II度水腫患者28例，III度水腫患者17例。MDA水平在III度水腫患者高于于II度水腫患者(3.23±0.53 mmol/mL vs 2.82±0.61mmol/mL，t=2.320，P=0.025)，而在II度水腫患者高于I度水腫患者(2.82±0.61mmol/mL vs 2.48±0.52 mmol/mL，t=2.269，P=0.027)（圖4A）。另一方面，SOD水平在III度水腫患者低于II度水腫患者(63.04±15.66 U/mL vs81.93±21.08 U/mL，t=3.192，P=0.003)，而在II度水腫患者低I度水腫患者(81.93±21.08 U/mL vs94.71±16.93 U/mL，t=2.553，P=0.013)（圖4B）。

CRPSI患 者 中Brunnstrom 1/2級 患 者24例，Brunnstrom 3級患者26例，Brunnstrom 3級患者25例。CRPSI Brunnstrom 4級患者血清MDA低于3級患者(2.42±0.54 mmol/mL vs 2.78±0.62 mmol/mL，t=2.186，P=0.033)，Brunnstrom 3級患者血清MDA水平低于1/2級患者(2.78±0.62 mol/mL vs 3.13±0.50 mol/mL，t=2.182，P=0.033)（圖4C）。而CRPSI患者血清SOD水平Brunnstrom 4級雖然高于3級，但未達到統計學差異(88.99±20.90 U/mL vs 86.83±22.40 U/mL，t=0.356,P=0.723)，Brunnstrom 3級患者血清SOD水平高于1/2級患者(86.83±22.40 U/mL vs 71.87±18.51 U/mL，t=2.561，P=0.014)（圖4D）。

圖4 血清MDA和SOD水平在不同肢體水腫分度和Brunnstrom分級中的表達

4 討論

腦梗死是導致中老年人群致殘率增加、日常生活能力缺失的重要原因之一。CRPS是腦卒中常見的并發癥之一，表現為患側肩部、腕、手等部位的疼痛、水腫、營養障礙、肌肉萎縮和肌力下降，且伴有不同程度的肢體功能受限[18]。反復持續的肢體疼痛、腫脹使患者遭受極大的身心折磨，嚴重影響患者肢體功能的恢復。腦卒中發生CRPS的病理生理機可能為腦缺氧缺血后導致大腦皮質結構重組，并誘導外周及中樞系統感覺過敏，異常神經沖動逆向傳導入外周神經末梢后釋放致痛介質,導致局部疼痛、血管擴張和毛細管通透性增加而誘發肢體水腫[19]。CRPS通常發生于腦卒中發病的1～3個月內，病程可持續數周或數月，其疼痛常呈頑固性，治療效果較差。

迄今為止還沒有針對CRPSI的特異性具體實驗室檢查項目；目前CRPSI的診斷主要基于對體征和癥狀的臨床觀察以及某些特定的檢查方法：WHO三級鎮痛階梯、定量感覺測試(QST)、自主測試（包括對出汗異常的定量發汗軸突反射測試(QSART)、冷加壓試驗結合熱成像觀察血管收縮反應以及激光多普勒血流測定法監測血管舒縮控制[20]。

本研究表明CRPSI患者中的氧化應激及其變化可能是CRPSI的發病機制。既往研究表明除了外周和中樞神經、自主神經缺血[21]，炎癥也被認為在參與CRPS的發病機制有關[22]。實驗研究和臨床研究數據均表明，組織損傷、神經源性炎癥和缺血再灌注損傷都可能導致自由基的過度產生[23]。而自由基可以增加血管滲透性，釋放神經肽(如P物質)，增強炎癥并導致進一步的組織損傷[24]。此外，許多臨床試驗表明，自由基清除劑維生素C和二甲基亞砜(DMSO)等可以減輕CRPSI患者的癥狀和體征[25-26]。

本研究發現血清MDA與SOD分別與VAS評分呈正相關和負相關，血清MDA水平與Constant-Murley評分、Cooney評分和Carroll評分分別負相關性，而血清SOD水平與Constant-Murley評分和Carroll評分正相關性。表明氧化應激水平約高，CRPSI患者疾病程度就約嚴重，功能程度也越差。根據本文結果我們推測，在CRPSI中出現疼痛以及其它癥狀至少有部分是由自由基導致的，因為各種自由基對神經元的損傷可導致神經病理痛。MDA的升高與神經病理痛和自由基誘導的損傷相關的機制密切聯系。MDA水平的增加與神經組織中抗氧化防御酶的減少有關[27]。細胞脂膜中不飽和脂肪酸的結構破壞引起組織損傷是活性氧的產生而造成損害。而MDA在大鼠酒精性神經病變發展過程中氧化應激的產生和維持中發揮了重要作用[27]。而另一方面，SOD被證明可有效緩解因自由基損害而產生的神經病理痛[28]。

本研究仍然存在一些局限性。例如，測定其他抗氧化劑和氧化劑狀態的化合物可能會獲得其他更多的信息。其次，其他與疾病無關的潛在混雜因素（如飲食）可能影響血清MDA或SOD的水平。最后血清SOD的降低和MDA水平的增高的與CRPSI患者癥狀之間的關聯并不能決定其因果關系，因此使用抗氧化藥物是否能改善腦梗死后CRPSI患者的癥狀需進行進一步的臨床研究。

總之，血清氧化應激/抗氧化產物可能參與了CRPSI的病理生理進程，這在血清中可以得到反映，對CRPSI患者的診斷和治療可能具有重要意義。