MicroRNA在肺小結節鑒別診斷中的研究進展

侯雅超，陳昌國，韓瑞

2022年全球最新癌癥統計數據顯示，肺癌發病率雖不是首位，但致死率高達21%，仍居第一[1]。我國最新統計數據顯示，肺癌發病率及致死率仍為首位，2016年我國新肺癌82.8萬例，約占總發病人數的20%[2]。

組織學上，肺癌主要分為小細胞肺癌（smallcell lung cancer,SCLC）和非小細胞肺癌（non-smallcell lung cancer,NSCLC），NSCLC占肺癌總病例數的80%以上[3]。肺癌起病隱匿，不易發現，早期無明顯臨床癥狀，主要表現是影像學提示的肺部小結節。肺癌致死率較高重要原因之一是缺乏早期特異性臨床癥狀，多數肺癌患者首次診斷時已處于晚期，預后相對不好[4-5]。研究表明，IA期肺癌患者5年生存率約77%～92%，而IVA期肺癌患者5年生存率僅為10%[6]。因此，尋找有效、準確的手段來提升肺癌早期診斷率，對于改善肺癌患者預后、延長生存期尤為必要。

低劑量計算機斷層掃描(low-dose computed tomography,LDCT)是目前肺癌早期篩查的主要手段。隨著人們健康意識的提升及診斷儀器分辨率的增高，肺部影像學檢查中發現不明原因小結節的數量逐漸增多。肺部小結節在普通人群中檢出率最高可達8%，高危人群甚至可達50%[4]。LDCT篩查雖在臨床廣泛應用，但較高的假陽性率易導致過度治療[7]。此外，LDCT對于惡性肺小結節診斷的準確率與影像醫生及胸外科醫生讀片水平密切相關，對其自身積累的臨床經驗有較高的依賴性[8]。那么，提高肺小結節檢出率的同時，如何合理判斷肺小結節良惡性成為肺癌早期篩查和診斷的關鍵問題之一。肺結節（特別是＜10 mm的肺小結節）進行組織活檢有一定難度，如何有效利用非有創診斷手段提升LDCT篩查的準確率是亟需解決的問題。液態活檢作為體外診斷的一個分支，以非侵入式獲取血液及體液中相關標志物檢測信息，是腫瘤早期診斷、輔助治療的突破性技術[9]。隨著液體活檢技術的興起及部分microRNA用于結直腸癌、肝癌早期診斷臨床產品的應用，microRNA用于腫瘤早期診斷、鑒別診斷、預后評估等又成為腫瘤標志物的研究熱點。microRNA是一類小的單鏈內源性非編碼RNA，是液體活檢的重要成員[10]。microRNA通過調控細胞周期、腫瘤細胞的侵襲和轉移、腫瘤相關血管生成、腫瘤細胞代謝和細胞凋亡等過程,從而可促進或抑制腫瘤的發生、進展[11]。microRNA在肺癌早期診斷方面的應用亦有較多研究，可用于肺癌液體活檢的標本有外周血、痰液和支氣管肺泡灌洗液等[4]，這些標本具有相對易于獲得、可重復采樣和非侵入性的優勢。本文就近年來microRNA在肺小結節鑒別診斷方面的研究進展進行綜述如下。

1 MicroRNA

microRNA是一類18～22個核苷酸長的內源性非編碼RNA。大多數動物體內發現的microRNA可與目的基因mRNA 3'UTR形成完全或不完全堿基配對，從而促進靶基因mRNA降解或抑制靶基因mRNA翻譯[12-13]。研究表明，microRNA可在細胞凋亡、分化和增殖等多個階段參與靶基因表達調控，且microRNA異常表達與腫瘤細胞增殖、轉移、侵襲和血管生成等生物學過程密切相關[14]。microRNA以下幾個特點使其具備成為腫瘤標志物的“潛質”：（1）在進化過程中高度保守；（2）在生理或病理條件下可由正常細胞分泌到體液中，也可由凋亡或壞死細胞釋放到體液中，從而進入體液循環；（3）在血清、血漿、尿液、乳汁和胸水等體液中均可檢測到特異性microRNA；（4）腫瘤細胞和相應正常組織中均有特異性microRNA表達譜，且特異性microRNA表達譜與腫瘤進展階段高度一致[15]；（5）不同體液中microRNA相對穩定，與其能和蛋白結合形成復合物有效抵抗RNase降解有關；（6）體液中游離microRNA可耐受煮沸、高/低pH、RNase等處理，甚至在反復凍融多次、室溫放置24 h等嚴苛情況下其含量仍保持相對穩定[16]。

2 MicroRNA與肺癌

肺癌早篩是一項重要的公共衛生問題。為改善肺癌“兩低一高”（早期檢出率低，5年生存率低，病死率高）現狀，完善和落實肺癌早發現、早診斷和早治療策略，除努力提高LDCT診斷效率外，一些出現的新技術可作為實驗室檢測的手段[17]。液態活檢技術就是一種較好的補充，利用液體活檢技術可檢測到不同進展階段及不同腫瘤部位釋放的生物標志物，實現實時監測腫瘤細胞相關分子變化的目的，較為全面反映惡性腫瘤不同分子表達譜變化，可較好解決腫瘤異質性給腫瘤早期診斷帶來的挑戰[18]。microRNA作為液體活檢的重要成員，越來越多的研究團隊將microRNA應用于肺癌早期篩查及診斷，作為LDCT的補充輔助診斷方法，單獨或聯合應用以提高肺癌早期診斷準確率。

2.1 MicroRNA在肺癌早期診斷中的價值在過去幾年中，基于循環中microRNA檢測用于肺癌早期診斷的研究較為廣泛，研究結果均提示microRNA可作為肺癌早期診斷，且具有良好的敏感性和特異性[19]。Monika等[20]對NSCLC組織和癌旁組織中差異microRNA檢測發現，NSCLC組織中miR-17表達顯著低于癌旁對照組（P=0.0178），隨后，他們通過ROC曲線分析進一步明確miR-17在早期診斷NSCLC方面具有較大價值，認為miR-17可用于區分腫瘤組織與手術切緣，且miR-17表達水平與NSCLC組織型分化程度呈一定相關性。Ernest等[21]對70例肺癌患者和22名非癌癥受試者(non-cancer subjects,NC)血清樣本microRNA表達譜分析發現，miR-193b、miR-301、miR-141和miR-200b這4個microRNAs可有效區分肺癌患者與NC患者，認為這組microRNAs有較大潛力作為LDCT前實驗室輔助篩查的生物診斷標志物。此外，有關microRNA對于NSCLC診斷價值的Meta分析亦有較多報道。Cheng等[22]分析發現，miR-148/152家族對于診斷NSCLC具有良好的敏感性和特異性，可作為NSCLC診斷的新型無創診斷生物標志物。microRNA SNP與肺癌易感性亦有少量報道，Zou等[23]發現miR-155和MIR155HG rs767649多態性是NSCLC易感性的潛在因素，但缺乏較為嚴謹、確鑿的實驗證據，其具體分子機制有待進一步研究。

此外，不同組織來源腫瘤細胞和對應組織均有各自特征性microRNA表達譜。Pavel等[24]通過NGS技術對肺癌患者和良性對照組主支氣管上皮細胞microRNA表達譜測序發現，肺癌患者支氣管上皮細胞中miR-146a-5p、miR-324-5p、miR-223-3p、miR-223-5p下調；進而將miR-146a-5p與現有肺癌腫瘤標志物聯合用于肺癌早期診斷，證實可顯著提高診斷效能。有學者嘗試將痰液中microRNA檢測作為肺部結節的診斷標志物。Roa等[25]對NSCLC患者痰液中miR-21、miR-145、miR-155、miR-205、miR-210、miR-92、miR-17-5p、miR-143、miR-182、miR-372和let-7a進行檢測，發現miR-21、miR-143、miR-155、miR-210、miR372可有效區分NSCLC患者，將這組microRNAs前瞻性應用于24例NSCLC病例和6例陰性對照病例，結果提示這組microRNAs用于NSCLC診斷，其靈敏度為83.3%，特異度為100%。

2.2 MicroRNA與肺癌預后microRNA不僅可用作肺癌輔助診斷，還可用于肺癌治療效果評價及預后評估。Xu等[26]通過檢測43例NSCLC患者1個周期鉑類藥物化療前后血漿中miR-32表達量，結果表明血漿miR-32表達水平與患者鉑類藥物化療效果及患者生存期有一定相關性，認為miR-32檢測可用于預測NSCLC患者鉑類化療療效和預后評估。Yang等[27]檢測73例肺腺癌患者癌組織和癌旁組織中miR-421表達量，運用Kaplan-Meier生存曲線進行分析表明，miR-421表達水平較高的肺腺癌患者總生存期(overall survival,OS)較miR-421表達水平低的microRNA患者要低，miR-421高表達是肺腺癌不良預后的獨立預測因子。

3 MicroRNA與肺結節鑒別診斷

目前，組織活檢是肺癌確診的金標準，但這類活檢手術有引起嚴重并發癥的風險，如氣胸、肺實質出血、肺部感染等[28]。臨床操作中，當肺小結節直徑＜10 mm，進行組織活檢難度較大，造成漏診、誤診的機率大幅增加。LDCT是現階段肺癌篩查和早期診斷的有效方法之一，但隨著假陽性結節大量檢出，需要其它篩查手段加以補充以提高肺癌早期診斷準確率。

目前，眾多研究均認為microRNA在肺結節中早期診斷中有較大價值，且可作為鑒別良惡性小結節的腫瘤標志物[29-30]。He等[8]聯合檢測血清miR-199a-3p、miR-148a-3p、miR-210-3p、miR-378d和miR-138-5p發現microRNAs檢測有助于降低CT掃描診斷的假陽性率，提高LDCT鑒別肺良惡性結節的診斷效能。Xi等[31]對57例接受手術的肺結節患者（15例良性肺結節患者和42例惡性肺結節患者）血漿中12種microRNAs表達水平進行檢測，發現NSCLC患者血漿中miR-17、miR-146a、miR-200b、miR-182、miR-221、miR-205、miR-7、miR-21、miR-145和miR-210表達水平顯著高于良性肺結節患者，且這些microRNAs均有較高靈敏度（54.8%～83.3%）和特異度（60.0%～86.7%）；該團隊繼而從這 組microRNAs中 選 取miR-146a、miR-200b和miR-7與LDCT聯合建立診斷模型并對該模型診斷肺結節的性能進行評估，結果表明該診斷模型在訓練集中對NSCLC診斷的靈敏度和特異度分別為92.9%和83.3%；驗證集中對NSCLC診斷的靈敏度為71.8%，特異度為69.2%，顯示出良好的診斷效能，可有效輔助辨識肺結節性質[32]。

盡管有研究認為凝血過程可能影響血清中microRNAs水平，但較多研究亦采用血清作為檢測microRNA的介質[4]。除直接進行檢測外，有學者嘗試利用microRNA檢測值比率用于肺小結節的鑒別診斷。Fan等[33]對正常對照組和NSCLC組miR-15b-5p/miR-146b-3p、miR-20a-5p/miR-146b-3p、miR-19a-3p/miR-146b-3p、miR-92a-3p/miR-146b-3p和miR-16-5p/miR-146b-3p比值進行了分析，發現NSCLC組microRNA組合比值顯著高于良性肺結節組，認為這五種血清microRNAs組合比值是鑒別良性肺結節和NSCLC的獨立診斷因素。

外泌體是一種微型載體，可用于microRNA動員、保護和運輸microRNA，并通過將其內容物運輸到腫瘤微環境中的靶細胞來影響細胞間通訊。因此，外泌體來源microRNA被認為是理想的循環腫瘤標志物之一[17]。腫瘤來源的外泌體在腫瘤發生、發展、診斷和治療中發揮重要作用[34]。有研究表明，外泌體microRNA可以有效區分不同亞型的NSCLC，如腺癌和鱗癌[35]，因此有研究提出外泌體來源microRNA可作為NSCLC的潛在診斷生物標志物[36]。Gao等[17]利用NGS測序技 術分析 了254例早期肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）患者、76例良性肺結節（benign pulmonary nodules,BPNs）患者和130名健康對照患者（healthy control patients,HCs）血漿樣本中外泌體microRNA表達譜，建立診斷特征模型并進行多中心驗證發現，miR-106b-3p、miR-125a-5p、miR-3615和miR-450b-5p組成的診斷特征組合可用于LUAD的早期檢測。Zhang等[36]同樣利用血漿外泌體來源microRNA構建SVM(support vector machine)診斷模型并驗證，發現SVM模型可準確區分肺良性結節和肺惡性磨玻璃結節。Yang等[37]使用血清外泌體提取試劑盒從外周血血清中提取外泌體，然后通過RT-PCR檢測了miR-21和Let-7a水平，結果表明miR-21/Let-7a在NSCLC患者的AUC曲線下面積為0.7539；靈敏度和特異度分別為56.00%和82.61%，具有較好的鑒別診斷效能。

4 總結與展望

綜上所述，LDCT在準確鑒別診斷肺部結節良惡性方面存在較大挑戰，尤其是直徑＜10mm的肺小結節。液體活檢技術的出現與發展為肺小結節良惡性鑒別診斷提供了一種新的無創方法。microRNA作為液體活檢的重要成員，可作為LDCT聯合診斷的實驗室手段來提高LDCT診斷效能。然而，目前microRNA相關研究尚存在一定的局限性，如：（1）大多數為樣本量較小的回顧性研究對結論的推論有一定影響；（2）手術的良性肺結節患者比例相對較低，會降低診斷效率[32]。（3）大多數研究為單中心驗證診斷模型，需要多中心及更大樣本量的驗證。隨著，用于結直腸癌早期篩查miR-92a檢測試劑盒及肝癌microRNAs檢測組合試劑盒的上市，特征性microRNA作為不同癌種早期篩查的臨床前景也越來越被看好。相信，隨著microRNA在區分良惡性肺小結節方面研究的不斷積累，未來microRNA有望與LDCT聯合用于肺部結節的良惡性鑒別診斷，以期提高肺小結節的鑒別診斷效率。