牛結節性皮膚病病毒基因組學研究進展

翟 頎，黃敏霞,.2，呂殿紅,3，賈春玲，周秀蓉，溫肖會,3，羅勝軍,3

（1.廣東省農業科學院動物衛生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站廣東 廣州 510640；2.仲愷農業工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510225；3.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室肇慶分中心，廣東 肇慶 526238）

牛結節性皮膚病（Lumpy Skin Disease,LSD）是一種由牛結節性皮膚病病毒（Lumpy Skin Disease Virus，LSDV）引起的高度傳染性疫病。臨床上，發病牛通常發熱（40～41.5 ℃）并持續1～3 d，體重減輕，產奶量減少或停止產奶，流涎、流淚和流膿性或粘膿性鼻涕，全身淋巴結體積增大，單個或多個圓形皮膚結節局部性或廣泛性出現，多出現在頭部、頸部、背部、乳房、會陰、生殖器、四肢和尾巴等毛發稀疏區域［1］。皮膚結節潰爛會招引蠅蛆而繼發細菌感染，傷口數月無法愈合，最后留下可深入到肌肉組織的永久性痘疤，嚴重降低皮革制品的質量［2］。LSD 發病率差異很大（5%～90%），死亡率通常較低（10%以下），但在個別疫情中可達到85%，偶發巨大差異的死亡率可能與牛品種、毒株毒力、動物健康狀態以及傳播媒介類型等密切相關［3-4］。LSD 給疫情國家的養牛業造成重大經濟損失［5-7］。該病被世界動物衛生組織列為必須報告的牛疫病之一，我國農業農村部也將其列為二類動物疫病。

1929 年LSD 首次發現于非洲的贊比亞，之后幾十年主要在撒哈拉以南的非洲地區和國家呈地方性流行［8-10］。20 世紀80 年代后期LSD 開始侵入中東國家，科威特是非洲以外首個發現LSD 的國家，之后LSD 迅速擴散［11-12］。2013 年土耳其首次報告LSD 疫情，由此LSD 抵達歐洲東南部，持續影響10 多個歐洲國家［13］。2015 年俄羅斯首次暴發LSD 疫情，2016 年哈薩克斯坦在距離俄羅斯邊境80 km 的地方第一次報告LSD 疫情［14］。2019 年LSD 首次擴散到亞洲東部和南部，中國、印度和孟加拉國均有報告。自2020 年以來LSD先后暴發于 尼泊爾、不丹、越南、緬甸、斯里蘭卡、泰國、馬來西亞、柬埔寨、老撾和蒙古［15］。我國首次確診的LSD 病例發生在2019 年8 月新疆維吾爾自治區伊犁州［16］，此后LSD 疫情迅速擴散，據中國動物疫病預防控制中心公布，目前國內LSD 疫情已波及安徽、福建、江西、廣東、浙江、臺灣、四川、重慶、香港、內蒙古、山東、廣西、寧夏、海南、陜西和云南。本文著重就近年來LSD 的病原學及病原基因組的研究進展進行綜述，以期對LSD 的防控和深入研究提供借鑒。

1 LSD 病原學研究進展

1.1 LSDV 的分類及形態結構

LSDV 是LSD 的病原體，屬于痘病毒科（Poxviridae）脊索痘病毒亞科（Chordopoxvirinae,ChPV）［17］，與山羊痘病毒（Goatpox virus,GTPV）和綿羊痘病毒（Sheeppox virus,SPPV）均為山羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV）。目前在血清學上無法區分LSDV、SPPV 和GTPV，三者還可以發生交叉反應。從一種CaPV 感染恢復后，可對其他CaPV 產生免疫力。

痘病毒是最大的動物病毒，病毒粒子呈磚形或卵圓形，LSDV 大小約為290 nm×270 nm［18］。宿主細胞質是LSDV 的復制場所，LSDV 感染細胞時主要以細胞外包膜病毒（Extracellular Enveloped Virus，EEV）和細胞內成熟病毒（Intracellular Mature Virus，IMV）形式存在，但主要以穩定性更好的IMV 形式存在于細胞內，直至細胞裂解后感染另一個宿主。EEV 由IMV 發展而來，其包被來源于高爾基體或內質網的囊膜［19］，與IMV可通過形態結構上是否有包膜包被而進行區別。IMV 或EEV 最里面部分是一個中間內凹、形似啞鈴狀的核心，核心由線性雙鏈DNA 和多種酶組成（圖1）；靠近核心的是柵欄狀核心膜；核心凹陷的中心是性質尚未清楚的側體；核心和側體一起被2 層脂溶性外膜包圍，厚度為50～55 nm；病毒外膜上還有很多不規則分布的管狀結構蛋白，使裸露的病毒粒子表面呈現紋理結構［20-21］。

圖1 LSDV 病毒粒子形態結構［21］Fig.1 Morphological structure of LSDV virus particles

1.2 LSDV 的理化性質和生物學特性

LSDV 不耐熱，一般55 ℃ 加熱2 h，或65 ℃加熱30 min，均可使其滅活［22］。LSDV 也不能被陽光直射，不耐酸或堿，對大多數常用消毒藥敏感。在pH 6.6～8.6 條件下，LSDV 非常穩定，37 ℃細胞培養5 d 沒有明顯降低病毒滴度。LSDV耐凍融，用細胞培養液4 ℃保存6 個月，或用皮膚結節組織-80 ℃保存10 年，LSDV 均可以恢復毒力。

LSDV 可用敏感細胞培養，但是細胞可供選擇的范圍很窄，傳統上使用牛、山羊和綿羊等反芻動物來源的原代細胞培養，如羔羊睪丸細胞（LT）、羔羊腎細胞（LK）、胎牛肌肉細胞（FBM）和胎牛皮膚細胞（FBS）。這些原代細胞系容易被污染，生產過程耗時耗力且有違動物福利。綿羊睪丸細胞（OA3.Ts）也可以支持LSDV 的增殖，但是該細胞和原代細胞一樣，生長緩慢，傳代次數有限［23］。因此，越來越多研究工作者使用牛腎細胞（MDBK）進行病毒分離，這是目前增殖LSDV 較優的細胞選擇。由病牛的皮膚結節和痂皮都含有高濃度LSDV 可知，LSDV 對上皮細胞具有嗜性［24］，而MDBK 細胞是一種源于LSDV 本體宿主牛的腎臟細胞，可貼壁生長，具有上皮特性，而且MDBK 細胞較原代細胞和O A3.Ts 細胞具有生長速度快、不易污染、成本低等優越性。有學者發現MDBK 細胞不但適用于從臨床樣本分離LSDV，還適用于生產LSDV 減毒活疫苗［25］，有利于解決目前使用原代細胞生產疫苗時難以保證不被外源因子污染的質量問題。也有科學家使用非洲綠猴腎細胞（Vero）培養改造后的LSDV分離株，在培養細胞中也能產生較高的病毒滴度［26］。此外，LSDV 可以通過雞胚接種分離［27］。在LSDV 的動物感染實驗中，采用靜脈注射接種較皮內接種的臨床癥狀更明顯。

2 LSDV 基因組學研究進展

2.1 LSDV 基因組結構

CaPV 的3 種病毒均高度保守，相似性高達96%，LSDV 基因組幾乎包含了SPPV 和GTPV 的所有基因［28］。LSDV 基因組有約151 kb，G+C 含量很低，有1 個保守的中央編碼區，兩端是變異程度較高的反向末端重復序列（Inverted Terminal Repetitions，ITRs），大小約為2.4 kb［29］。LSDV基因組最多有156 個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），中間保守基因編碼的蛋白質涉及DNA 復制、轉錄、mRNA 合成、核苷酸代謝、結構形成和穩定、毒力和宿主范圍，基因組兩端則是基因家族與毒力和宿主范圍功能密切相關的基因，如LSDV132 作為LSDV 獨特的基因，可能行使毒力和宿主范圍功能，而在SPPV 和GTPV 基因組中受破壞而限制了宿主范圍［30-31］。

2.2 LSDV 基因組測序研究

2.2.1 對非洲地區LSDV 毒株全基因組的研究 LSDV 起源于非洲，2001 年科學家對1958 年在肯尼亞首次分離的Neethling 2490 毒株進行了全基因組序列測定分析，該病毒株在分離后接種于LT 細胞培養16 代，并在1987 年回歸奶牛接種傳代［28］。提取的病毒DNA 被Tsp509 Ⅰ外切酶剪切成1.0～6.0 kb 大小的片段，在Applied Biosystems PRISM 3700 自動DNA 測序儀上完成雙脫氧測序反應。該病毒株的基因組全長150 773 bp，A+T 含量為73%，ITR 有2 418 bp，有156 個ORF，最小讀取的ORF 為162 bp，LSDV 的 結構和功能與ChPV 其他屬病毒關系密切，尤其牙塔痘病毒屬（Yatapoxviruses）和兔痘病毒屬（Leporipoxviruses）［28］。

KSGP 0240 株最初從綿羊中分離出來，由于該毒株感染綿羊和山羊只引起輕微的臨床疾病，因此被廣泛應用于針對GTPV 和SPPV 的免疫，疫苗接種效果很好，但對LSDV 的免疫保護不完全［32］。KSGP 0240 株長期被認為是SPPV，直到有學者測出KS-1 毒株（來源于KSGP 0240 減毒疫苗）全基因組序列才開始被認為是LSDV，ORF002、ORF155 和ORF013 在LSDV 毒株（包括KS-1 株）中均完整，而這些區域在SPPV 中均被破壞［33］。后來也有學者從肯尼亞Kenyavac疫苗（JOVAC）中測出KSGP 0240 株基因組序列（KX683219），測序結果與LSDV Neethling NI-2490 具有99.9%的同源性，不同之處僅在于單個氨基酸取代（LSDV049 中的P/Q）和單核苷酸缺失導致LSDV134 被截斷［34］。

LSDV 南非Neethling vaccine LW 1959 疫苗株是野外分離株在LK 細胞中連續傳代61 次，然后在雞胚絨毛尿囊膜（Chorioallantoic Membrane，CAM）中傳代20 次，再在LK 細胞中傳代3次，最后病毒在MDBK 細胞中再傳代10 次，在LT 傳代5 次后收獲以測全基因組序列，與南非Neethling Warmbaths LW 田間分離株比較發現，在基因組末端可變區共有438 處氨基酸替換，包含很多移碼突變（造成截短ORF）、缺失和插入，這些突變的編碼蛋白主要涉及宿主免疫應答調控、基因表達、DNA 修復和宿主范圍特異性以及其他未知功能［35］。2016 年對從納米比亞分離到的2 株LSDV 進行全基因組測序，結果發現，與Neethling Warmbaths LW 株相比有12 處相同的單核苷酸突變和2 處相同的氨基酸缺失；此外，Namibia/9/2016 有5 nt 突變，Namibia/10/2016 有27 nt 突變［36］。

2.2.2 對歐洲地區LSDV 毒株全基因組的研究 歐洲大陸第1 株LSDV 分離株是2015 年從希臘分離到的E vros/GR/15 株，該株病毒基因組有150 554 bp，A+T 含量為74.11%，ITR 有2 190 bp，與Neethling Warmbaths LW 株相比同源性為99.8%，存在9 個非同義SNP 突變（LD005、LD006、LD017、LD042、LD054、LD094、LD126和LD128），LD096 有1 個氨基酸缺失，3 個基因（LD013a、LD026a 和LD144）中存在移碼突變［37］。同年，俄羅斯從其北高加索地區分離到LSDV/Russia/Dagestan/2015 株，全長150 751 bp，與Evros/GR/15 株、Neethling Warmbaths LW 株相比同源性分別為99.9%、99.8%，該株病毒共有4個SNP 位點突變，1 個在LD145 和LD146 基因間隔區發生T/A 突變，1 個在LD076 中發生C/T 突變，2 個在LD128 中發生G/A 和T/A 突變并引發編碼氨基酸變化；此外，LD141 缺失1 個氨基酸，LD022 中有6 個堿基插入造成編碼氨基酸變化［38］。

2016 年對從塞爾維亞分離到的SERBIA/Bujanovac/2016 株進行全基因組測序，全長150 661 bp，ITR 有2 367 bp，與Neethling Warmbaths LW 株的同源性為99.95%，有12 個基因發生氨基酸突變，其中LD005 發生D/N 突變，LD006 發生E/K 突變，LD017 發生H/R 突變，LD059 發生C/F 突變，LD087 發生K/E 突變，LD094 發生S/L突變，LD126 發生E/K 和M/I 突變，LD128 發生S/F 突變，LD139 發生M/I 突變，LD148 發生R/K突變，LD096 缺失1 個賴氨酸，并且在ITR 區缺失15 nt；此外，編碼區有11 nt 變化，有8 nt 變化發生在基因間隔區［39］。

值得注意的是，多個LSDV 分離株在ITR 區發生了15 nt（TAAGTGGAAGCCAAT）的缺失，并且這種缺失穩定存在于2012—2017 年的部分流行株，如來自以色列（2012 年）、希臘（2015年）、塞爾維亞（2016 年）、俄羅斯（2015 年和2017 年）以及納米比亞（2016 年）的分離株［36］。

2.2.3 對LSDV 疫苗毒與野毒重組型毒株的研究 LSDV 基因組具有高度保守性和遺傳穩定性，田間分離株基因組間存在極小的遺傳變異，疫苗株基因組間也是如此。對LSDV 疫苗株Lumpyvax、Herbivac LS 和Vaccine-OBP 全基因組測序發現，3 種疫苗株與 Neethling vaccine LW 1959 株基因組之間具有99.9%核苷酸同源性，比較發現，3 株疫苗株均在LW056 發生T/M 突變，LW116 發生V/A 突變；此外，Lumpyvax 和Herbivac LS 疫苗株在LW037 發生G/V 突變，Herbivac LS 疫苗株在LW134 缺失2 nt 造成移碼突變而產生截短ORF，Vaccine-OBP 疫苗株在末端非編碼區缺失18 nt 且有3 個不影響編碼序列的單核苷酸插入或缺失［33］。

2016 年從克羅地亞接種了SIS-Lumpyvax 疫苗后發生不良反應的活牛上采集皮膚結節樣本（遠離注射部位），分離得到病毒Cro2016 株。在MDBK 細胞傳代8 次后測序得到Cro2016 株全基因組序列，該序列與SIS-Lumpyvax 疫苗核苷酸序列100%相似，證明疫苗接種的病毒序列保持穩定［40］。

哈薩克斯坦的弱毒疫苗株Neethling-RIBSP是基于2016 年該國第1 株野毒分離株Kubash/KAZ/16［41］改造，將該毒株在LT 細胞中傳代49次、在雞胚CAM 中傳代5 次、再在MDBK 細胞傳代33 次后獲得。對該疫苗株進行全基因組測序，發現與Kubash/KAZ/16 株的核苷酸同源性為99.96%，存在5處核苷酸突變（4處氨基酸被替換）、4 處基因間隔區的核苷酸插入和3 處大片段核苷酸缺失，其中編碼ankyrin 重復蛋白的LD007 缺失16 nt 造成移碼突變產生截短蛋白，LD016 缺失18 nt 造成編碼OX-2 樣蛋白缺失6 個氨基酸［42］。

痘病毒作為大型的雙鏈DNA 病毒，一般情況下相對穩定，在自然環境中不容易發生大的變異或重組。但在人們對痘苗病毒（Vaccinia Virus,VACV）起源的追溯過程中發現不尋常的情況。VACV 是不同痘病毒的復雜混合物［43］，共培養的天花疫苗與其他病毒，包括天花病毒（Variola Virus,VARV）和牛痘病毒（Cowpox Virus,CPXV）等，可能產生重組病毒。在VACV Lister 毒株里存在兩個 CPXV 樣基因［44］，此外在DPP17 天花疫苗亞克隆的一個區域也發現含有可編碼馬痘病毒（Horsepox Virus，HSPV）樣的SNP 序列［45］。這提示痘病毒也具有重組變異的可能。

2017 年從距離哈薩克斯坦邊境60 km 的俄羅斯地區1 頭有明顯臨床癥狀的奶牛中分離出LSDV/Russia/Saratov/2017 株，其基因組既包含減毒活疫苗的骨架，也包含田間分離株DNA 片段，確定其為第1 株自然發生的重組型毒株［46］。LSDV/Russia/Udmurtiya/2019 株也是從俄羅斯分離出來的重組毒株，可能由減毒Neethling 型疫苗株和肯尼亞KSGP/NI-2490 樣田間分離株重組而成，已識別出27 起與LSDV/Russia/Saratov/2017毒株不同的重組事件，發現幾種同樣的蛋白被反復恢復為野生型的全長蛋白，推測對毒力影響重要，包括含mutT 基序的蛋白（LW086 和LW087）、B 22R 同源物（LW134）和Kelch 樣蛋白（LW144）［29］。Biswas 等［31］比較CaPV 疫苗株與分離株，發現了一些編碼ankyrin 重復蛋白、Kelch 樣蛋白、B22R 同源物、mutT 和超氧化物歧化酶的基因，可能與調節毒力和宿主范圍相關。2020 年在我國廣東發現了第3 株能引起典型LSD暴發的重組毒株（China/GD01/2020），與2017年和2019 年在俄羅斯發現的2 種重組毒株存在不同的重組模式［47］。

雖然新型重組LSDV 已被證實流行，但LSDV基因組序列的遺傳穩定性仍毋庸置疑，因為重組毒株的基因片段都能在LSDV 疫苗毒株或田間毒株中找到近乎100%相似的區域。LSDV 基因組非常龐大，多達156個開放閱讀框，假想基因也較多，很多基因編碼產物的功能還不確定，尤其是存在于疫苗毒株和野毒株基因組之間的堿基突變、缺失和插入造成的變異基因功能尚無法確定。

3 展望

LSD 是一種對國際貿易有重大影響意義的牛傳染病。目前防控LSD 仍依賴減毒活疫苗接種，但減毒活疫苗并非完全安全、穩定和有效。近年來通過對LSDV 全基因組測序分析，在亞洲部分地區發現了疫苗毒株和田間毒株的重組毒株，而且重組毒株可以流行并致病。在我國南方地區，尤其是廣東的肉牛養殖主要以小規模散養為主［48］，牛只感染LSDV 的風險較高。目前我國官方推薦使用異源山羊痘AV41 株減毒疫苗來預防LSD。我們對廣東地區和廣西地區的LSDV 毒株進行全基因組測序分析發現，2020 年兩廣地區暴發的LSD 疫情均由重組病毒株引發；對該重組毒株進行病毒重組事件分析，其一個可能的次要親本正是我國目前在使用的GTPV-AV41 減毒活疫苗（課題組未發表數據）。雖然目前還沒有更多LSDV 和GTPV 發生重組的證據，但是為了生物安全，未來需要重新評估部分減毒活疫苗的安全性和有效性，并加緊研發其替代品，如滅活疫苗或亞單位疫苗。

此外，為了控制LSDV 在我國進一步傳播擴散，迫切需要在全國更大范圍內調查LSDV 的真實流行情況。鑒于LSDV 基因組具有高度保守性和遺傳穩定性的特點，需要利用高通量測序技術對國內更多的LSDV 分離株開展全基因組水平測序、序列比較、遺傳進化和重組事件分析，以便監測分析國內LSDV 流行毒株的遺傳演化過程和重組變異情況，進一步對LSD 疫情溯源提供線索，并為該病防控策略的制定提供科學依據。