乙型肝炎病毒相關慢加急性肝衰竭患者血清miRNA差異表達譜及其預后預測價值

謝志偉 陸靄琪 楊可立 陳彬彬 關玉娟 肖光明 李劍萍

肝衰竭是由多種因素引起的嚴重肝臟損傷，病死率高。乙型肝炎病毒相關慢加急性肝衰竭(hepatitis B virus-related chronic and acute liver failure，HBV-ACLF)占肝衰竭總數的81.80%[1]。ACLF病理生理機制復雜，發病機制尚不明確[2, 3]。研究發現，miRNA參與了生物體多種生理過程，如在HBV感染者血循環中多種miRNA的表達量發生變化，且隨著HBeAg狀態不同，其miRNA表達不一樣，HBeAg陽性患者的血清miRNA-122-5p、miRNA-125b-5p、miRNA-192-5p、miRNA-193b-3p及miRNA-194-5p水平較HBeAg陰性患者高[4-7]。miRNA通過調控死亡受體介導的肝細胞凋亡來參與肝衰竭的發病，miRNA-122-3p可以作為HBV-ACLF預后獨立預測因子，HBV-ACLF死亡患者血清miRNA-200a表達水平明顯高于生存患者[8-10]。針對目前HBV-ACLF臨床治療效果差，本研究擬尋找早期診斷、預測HBV-ACLF臨床療效及預后的miRNA。

材料與方法

一、研究對象

納入2018年5月至2019年5月就診于廣州醫科大學附屬市八醫院乙型肝炎病毒感染患者，HBV-ACLF診斷標準參照《肝衰竭診治指南(2018年版)》[11]。納入標準：①年齡18～65歲，性別不限；②HBsAg 陽性持續 6 個月以上；③血清總膽紅素≥10×ULN 或每日上升≥17.1 μmol/L；凝血酶原活動度≤40%或 INR≥1.5；④能理解本研究并簽署知情同意書，并且遵守本研究的要求。排除標準：①合并HIV、HCV、HEV、HDV感染，合并自身免疫性肝炎、酒精性肝病、代謝性肝病等肝病；②合并其他器官嚴重的基礎性疾病；③依從性差。

研究分為HBV-ACLF組、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)組及健康對照(healthy control，HC)組；HBV-ACLF組再分為好轉組與未愈組，未愈組定義為患者出院時肝功能變差或死亡；收集患者臨床資料如人口學特征、病毒學指標、血常規、生化、凝血功能、電解質及纖維化指標。

二、微小RNA測序及數據分析

使用TRizol試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, 美國)從患者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中分離總RNA。為了獲得RNA的完整性和質量，使用安捷倫2100生物分析儀(安捷倫技術公司)測量每個樣本的RNA完整性數(RIN)值。按照制造商的協議，使用NEB Multiplex Small RNA library Prep Kit (New England Biolabs Inc.)制備文庫。康宸生物技術(上海)在Illumina-NextSeq500平臺上進行高通量測序和數據分析，首先對原始數據進行修剪和處理，調整后P<0.05視為差異表達。

三、實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)驗證miRNA

利用SYBR Green PCR試劑盒對CFX-96進行實時Q-PCR分析，分析所選miRNA和一個內參U6基因的表達情況。采用標準2-ΔCt法計算miRNA的表達。

四、統計學分析

采用SPSS Statistics 25.0分析數據。正態分布的計量資料用均數±標準差表示，采用兩兩比較的Student’t檢驗，偏態分布的計量資料以M(P25，P75)表示，比較采用Mann-WhitneyU檢驗；3組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、患者人口學及臨床特征比較

共納入75例研究對象，男59例，女16例，年齡(39.7±9.1)歲；HBV-ACLF組30例，年齡39.0(34.8，48.3)歲，男25例(占83.3%)；CHB組20例，年齡38.5(27.0，49.8)歲，男12例(占70%)；HC組 25例，年齡38.0(33.5，43.0)歲，男20例(占80.0%)；3組研究對象年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。HBV-ACLF組與CHB組、HC組比較，具有較低的紅細胞計數、血紅蛋白水平、血小板計數及較高ALT、AST水平，且miRNA-144-3P、miRNA-205-5p、miRNA-96-5p、miRNA-137-3p、miRNA451a表達上調，差異均有統計學意義(均P<0.05)，而肌酐水平及白細胞計數差異無統計學意義(P>0.05)。

HBV-ACLF組患者30例，分為好轉組17例及未愈組13例，兩組性別、年齡、HBV DNA水平、白細胞計數、紅細胞計數、血紅蛋白水平、肝腎功能、電解質及纖維化指標差異無統計學意義(P>0.05)。與未愈組比較，好轉組具有更高的血小板計數及更好的凝血功能，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 HBV-ACLF好轉組與未愈組患者臨床特征比較

二、HBV-ACLF患者與HC患者miRNA表達譜

為明確miRNA在HBV-ACLF患者PBMC中表達情況及篩選出可能發揮作用的miRNA，采用Exiqon公司基于LNA(鎖核酸)開發的miRNA芯片分析技術，收集10例HBV-ACLF患者和5例健康人的PBMC分別進行基因芯片雜交驗證，然后合成比對。最后合成的miRNA-microarray芯片結果，與健康對照組人群比較，按照2倍倍數變化(fold change>2)，P<0.05，在HBV-ACLF患者體內65個miRNA發生了顯著變化，其中上調miRNA 25個(圖1A)，下調芯片miRNAs 40個(圖1B)。

圖1 通過基因芯片技術發現HBV-ACLF患者血清中表達異常的血清miRNA

三、miRNA 對 HBV-ACLF患者預后的預測價值

進一步擴大樣本，納入HBV-ACLF患者20例，CHB患者20例，選取同期健康人20例作為健康對照組，分析miRNA表達差異情況。HBV-ACLF組與CHB組、HC組比較，miRNA-144-3p、miRNA-205-5p、miRNA-96-5p及miRNA451a表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)。而miRNA-137-3p表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組研究對象miRNA表達差異情況

20例擴大驗證的HBV-ACLF患者中，好轉組11例，惡化組9例。兩組miRNA表達水平比較，miRNA-144-3P、miRNA-137-3p及miRNA451a表達差異無統計學意義(P>0.05)，好轉組miRNA-205-5p及miRNA-96-5p均為上調表達，且差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 HBV-ACLF患者好轉組與未愈組miRNA表達差異情況

討 論

本研究發現，與CHB患者及健康人群比較，HBV-ACLF患者紅細胞計數、血紅蛋白水平及血小板水平較低，與既往報道一致。研究發現，相比于非ACLF患者及健康人群，ACLF患者炎癥因子水平明顯升高[12, 13]。Lippi等[14]報道，炎癥因子如腫瘤壞死因子α、白細胞介素-1β及白細胞介素-6可能抑制鐵代謝和促紅細胞生成素的產生，導致合成障礙或促紅細胞生成素異常活動，這或許是ACLF患者紅細胞計數及血紅蛋白下降的原因。本研究也發現HBV-ACLF未愈患者血小板下降更明顯，凝血功能更差。許珊珊等[15]發現ACLF患者血小板下降明顯，且死亡組血小板比存活組下降更明顯，但2組血漿促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)水平無顯著差異，提示ACLF患者血小板減少的原因可能為消耗或重新分布，并非TPO水平下降導致血小板生成減少。

miRNA作為一種在轉錄后水平調控基因表達的內源性非編碼單鏈 RNA，不僅在不同疾病狀態下表達譜不同，而且可以穩定地存在于血液、血清等體液中。不同miRNA在肝臟疾病也發揮不同作用[6, 16]。本研究篩選HBV-ACLF患者血清中表達顯著異常的miRNA，發現與健康人比較，HBV-ACLF患者血清中有65個miRNA發生了顯著變化，其中上升最高的為miRNA 27-5P和 miRNA 199b-5P。有研究發現，肝細胞癌患者miRNA 199b-5P表達下調，而miRNA 199b-5P的過表達可抑制癌細胞聚集、細胞遷移及擴散，miRNA 27-5P的表達可抑制乳腺癌細胞的擴散及誘導腫瘤細胞周期的停止[17，18]。本研究擴大樣本后發現，與CHB患者及健康人群相比，HBV-ACLF患者miRNA-144-3p、miRNA-205-5p、miRNA-96-5p、miRNA-451a均表達上調，且好轉患者，miRNA-96-5p和miRNA-205-5p均上調表達。miRNA-96-5p可以減輕脂多糖誘導的炎癥反應，其主要機制為通過降低酰胺磷酸核糖轉移酶表達水平和抑制NF -κB通路，miRNA-205-5p可以抑制疤痕的形成，主要通過抑制人瘢痕疙瘩成纖維細胞的侵襲和遷移能力，及抑制血管內皮生長因子的表達從而抑制PI3K/Akt 通路[19，20]。而目前認為免疫調節失衡和過度的炎癥反應是ACLF發生發展過程中的重要病理生理機制[12, 21-23]，為此，通過免疫調節及抑制炎癥反應可以改善ACLF的預后。

綜上所述，miRNA-96-5p和miRNA-205-5p在HBV-ACLF患者中表達水平升高，且與HBV-ACLF患者預后密切相關，有望成為 HBV-ACLF 診斷和預后評價的新指標。由于本研究入組病例數相對較少，有待擴大樣本量進一步研究。