水稻根圍白葉枯病與細菌性條斑病生防細菌的篩選與鑒定

余山紅，謝關林，嚴成其

(1.臺州市農業科學研究院，浙江 臺州 317000；2.浙江大學 生物技術研究所，浙江 杭州 310029；3.寧波市農業科學研究院，浙江 寧波 315040)

水稻白葉枯病(bacterial leaf blight)和水稻細菌性條斑病(bacterial leaf streak，簡稱細條病)是目前嚴重威脅我國水稻生產的兩種重要細菌病害。白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，xoo)和細條病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，xooc)是水稻黃單胞菌屬下的2個致病變種，親緣關系極為接近。白葉枯病最早于1884年在日本岡縣發現，現在亞洲、非洲、美洲和澳大利亞等地均有發生，是許多國家的檢疫對象。該病在亞洲尤其在周年種植水稻的南亞和東南亞地區的危害最為嚴重，我國大部分地區均有發生，造成水稻減產10%～30%，嚴重可達50%以上。細條病于1918年在菲律賓首先發現，目前在東南亞各國和非洲中部都有發生。在我國部分地區此病發生嚴重，常年發生面積在460萬hm2以上[1]，尤其在我國南方部分稻區危害已超過白葉枯病[2-4]。

因長期大量使用農藥造成的自然生態環境污染及稻米農藥殘留問題越來越突出[5]，尋求作物病害防治的新途徑一直是人們努力的目標。拮抗細菌是一類重要的生物防治資源，在水稻病害的綜合防治中應該發揮更大的作用[6]。然而，由于地域條件、栽培方式及病原菌特性等的不同，生防菌在不同地方對病害的防治效果往往很不一樣，因此，根據各地的自然條件因地制宜地篩選適合某一區域使用的菌株是生物防治的關鍵[7]。本研究從水稻根圍分離細菌，通過室內拮抗菌篩選、溫室防病效果測定、水稻種子毒性及促生作用測定，以期篩選出有較好防病效果的生防細菌，為白葉枯病和細條病的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

白葉枯病和細條病樣品均采自浙江臨海，以組織分離法分離，經柯赫氏法則驗證后進行鑒定，確認為稻黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)和稻黃單胞菌稻生致病變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)后保存備用。

1.1.2 樣品采集

從浙江臨海已經混合發生白葉枯病和細條病的水稻田塊中，將發病植株連根拔起裝入樣品袋中帶回實驗室。

1.1.3 培養基

水稻根圍細菌的分離以及對峙培養采用的培養基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(NA)。配制病原菌和拮抗菌懸浮液使用的為牛肉膏蛋白胨培養基(NB)。

細菌脂肪酸鑒定過程中培養待測菌使用的為胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂培養基(TSBA)。

1.2 方法

1.2.1 水稻根圍細菌的分離

先抖掉水稻根圍松散的土粒，將根部切成0.2～0.7 cm的小段，混勻，然后稱取5 g混合樣品于無菌研缽中碾碎，用50 mL無菌水懸浮制成樣本母液。取母液l mL于裝有9 mL無菌水的試管中，依次稀釋成濃度梯度10-1～10-6的懸浮液，每個梯度分別取10 μL到NA平板上，用滅菌的涂布棒涂布均勻。放置20 min后將平板倒置于28 ℃培養箱中培養72 h，挑取典型菌落進行純化，4 ℃保存備用。

在校園內，也可能存在車輛超速的問題，對于存在問題的車輛，就可以利用智能警告系統對其行文進行警告，從而對車輛進行及時的處理。如果出現沒能及時處理的情況，就可以給指定人員發送聲音、郵件和短信，通告交通管理人員及時進行防范，避免引發事故[5]。該技術還可以和地圖結合起來，通過記錄車輛所經過的攝像頭，從而對車輛進行定位，并且能夠在地圖上還原車輛行駛的軌跡，并對車輛的位置進行查詢，保證交通管理的精度。

1.2.2 生防細菌的篩選

當三角瓶中的NA培養基融化后冷卻到45 ℃左右時，按體積比10∶1加入已在搖床NB培養基中振動培養72 h的病原菌懸浮液，搖勻，倒平板靜置4 h，在帶菌平板中央用接種環點接待測的細菌菌株。48 h后觀察并測量抑菌圈的直徑，挑選出同時對Xoo和Xooc抑菌能力最強的5個菌株。

1.2.3 溫室生防菌浸種防病試驗

將培養48 h的5株生防菌分別用無菌水配成濃度約為1.0×108mL-1的菌懸液。將水稻種子放入菌懸液中浸種48 h，催芽24 h后溫室盆栽播種。以清水浸種作對照。待水稻幼苗生長至1心2葉期時飽和噴霧接種濃度約為1.0×108mL-1的病原菌菌懸液，薄膜覆蓋保濕24 h。接種14 d后統計白葉枯病和細條病的發生情況，記載發病率和病級，病情分級標準參照國家標準[8-10]進行調查統計。

1.2.4 生防菌對水稻種子毒力和促生效果測定

將培養48 h的5株生防菌分別用無菌水配成濃度約為1.0×108mL-1的菌懸液。將水稻種子分別放入菌懸液中浸種48 h，催芽24 h后，播種于鋪有濕潤濾紙的培養皿中，以清水浸種作為對照。7 d后統計各處理種子的發芽率，測量幼苗根長、苗長。

脂肪酸甲基酯鑒定(FAMEs)試驗方法按美國MIDI公司的操作手冊進行[11]，菌株在TSBA培養基上28 ℃培養16～24 h，收集菌體40 mg，經皂化、脂化、抽提和洗滌，獲得脂肪酸甲脂。脂肪酸鑒定采用美國Agilent 6890型氣相色譜及MIDI公司開發的全自動微生物鑒定系統MIS 4.5(microbial identification system)和LGS 4.5(1ibrary generation software)。

16S rDNA序列測定參照已發表的細菌16S rDNA基因的通用引物序列[12]。正向引物27F為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。擴增反應總體積為50 μL，反應條件為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共進行35個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應在PTC-200型熱循環儀上進行，取5 μL擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測擴增效果。PCR產物純化與測序工作委托北京六合華大基因科技股份有限公司完成，將測得的細菌16S rDNA序列登陸NCBI數據庫進行比對。

1.2.6 數據統計與分析

試驗數據采用DPS軟件進行分析[13]。

2 結果與分析

2.1 生防細菌篩選結果

從水稻根圍土壤共分離到細菌51株，經過初篩后，獲得21株同時對Xoo和Xooc有拮抗能力的細菌，其中抑菌圈直徑小于20 mm的有16株，大于20 mm的有5株，根據菌落形態將其編號為A1、A2、B1、B2、C。

2.2 生防菌浸種對白葉枯病和細條病的防治效果

5個生防菌浸種處理對白葉枯病與細條病都有不同程度的預防效果(表1)，其中以菌株C和B2防效最為顯著，對白葉枯病的防效分別達到54.6%、49.9%，對細條病的防效分別達到57.4%、42.6%。

2.3 生防菌促生能力及毒力測定結果

對綜合拮抗能力最強的5個菌株進行水稻種子毒力測定，并檢驗是否具有促進種子萌發的效果。結果發現，5個菌株對稻種的生活力影響各不相同。菌株A1抑制水稻幼苗生長，A2抑制種子發芽，B1同時促進根和幼苗的生長，B2在促進種子發芽的同時抑制根的生長，C能促進根的生長(表2)。

表1 溫室生防菌對水稻白葉枯病與細條病的防治效果

表2 拮抗菌對稻苗生活力的影響

2.4 生防菌的鑒定

經過對A1、A2、B1、B2、C 5種生防菌進行FAMEs測定及16S rDNA序列比對，將其鑒定為2株洋蔥伯克氏菌(Burkholderiacenocepacia)、2株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和1株惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)(表3)。

表3 待測菌的脂肪酸分析及16S rDNA鑒定結果

3 小結與討論

利用拮抗細菌生物防治植物病害是當今植物病害十分活躍的研究課題，并已顯示出良好的應用前景[14-15]，使用對病原菌有拮抗作用的細菌是一種既經濟有效又無副作用的防治途徑[16]。而拮抗菌的篩選是一切生物防治的基礎，國內篩選、利用拮抗菌進行白葉枯病或細條病的生物防治已有大量研究，但篩選同時對兩種病原菌有抑制能力的生防菌還不多，已開發成能真正用于大田防治的生防菌劑更是少之又少。

目前，國內正式登記用于防治水稻白葉枯病和細條病的生物活性制劑僅有3種，分別是德強生物股份有限公司生產的100億芽孢·g-1枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(PD20140340)(用于防治白葉枯病)、陜西恒田生物農業有限公司生產的80億芽孢·g-1甲基營養型芽孢桿菌LW-6可濕性粉劑(PD20181621)(用于防治細條病)和江蘇省蘇科農化股份有限公司研制出的60億芽孢·mL-1解淀粉芽孢桿菌LX-11懸浮劑(PD20190018)(在兩種病害上同時獲得登記)。

此外，楊俊譽等[17]發現，農桿菌屬(Agrobacterium)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)為感染白葉枯病水稻植株特有的內生拮抗細菌屬，而節桿菌屬(Arthrobacter)和考克斯菌屬(Kocuria)僅存在于健康植株中。高玲玲等[18]從云南水稻根部分離到NR-18和NR-79兩株多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)NR-64。張芬等[19]從水稻根際土壤樣品中得到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)T429、伯克氏菌屬(Burkholderia)。劉郵洲等[20]從稻田分離獲得枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。胡凌鳴等[21-23]從校園植物根際土壤中分離到淡紫灰鏈霉菌(Streptomyceslavendulae)S1-10和玫瑰輪絲鏈霉菌(Streptomycesroseoverticillatus)Sr-63。李生樟等[24-26]從蔬菜根際土壤中分離到蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)512、蟲媒假單胞菌(Pseudomonasentomophila)1257、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)504。鄒路路等[27]從校園內健康孝順竹葉分離純化得到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BME 17。朱潤杰[28]從作物根際土壤中分離得到變棕溶桿菌(Lysobacterbrunescens)OH23。張琪等[29-30]從腐爛的水果、發霉的食物、土壤、空氣等不同生境中篩選到灰黃青霉(Penicilliumgriseofulvum)Pg-35、皮落青霉(Penicilliumcrustosum)Pc-28和菌核曲霉(Aspergillussclerotiorum)As-75。陳思宇[31]從江蘇植物根圍土壤中分離出枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、海洋解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefacien)。潘潔莉[32]分別從土壤、空氣中采集到越南伯克氏菌(Burkholderiavietnamiensis)Ja2和假單胞菌(Pseudomonas)Dc3。黃夢桑等[33]從辣椒根際土壤中分離篩選到高地芽孢桿菌(Bacillusaltitudinis)181-7。以上分離出的菌株均同時對白葉枯病菌和細條病菌有抑菌能力。

本研究中，我們也發現發病水稻植株根圍存在著大量能夠抑制白葉枯病菌和細條病菌生長的拮抗細菌，如洋蔥伯克氏菌(Burkholderiacenocepacia)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)等，而且部分細菌還具有促進水稻種子萌發和根系及地上部生長的作用，具有很好的應用前景。利用拮抗細菌進行生物防治受植物、病原物、拮抗細菌和環境條件等多種因素的影響，特別是其他微生物的競爭作用，使拮抗細菌的種群數量發生較大變化[34-35]，因此，生防細菌的定殖能力對于病害的防治效果非常重要。而根圍細菌能夠在寄主植物周圍環境中很好定殖，不易受環境條件的影響，一般比外來拮抗菌具有更強的定殖能力，在病害的生物防治上更具有優勢。由此可見，植物根圍是獲取生防菌的良好來源。本研究拓寬了水稻白葉枯病和細條病生防菌的分布范圍，為該病害的生物防治提供了重要資源。