華重樓種子無菌萌發(fā)及實(shí)生苗培養(yǎng)初探

唐興國(guó)，周全，陳銀龍，米敏

(1.臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臨海 317000；2.武漢宜稞生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，湖北 武漢 430415)

華重樓是我國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材，是廣義百合科重樓屬(Paris)多種植物的統(tǒng)稱，以干燥根莖入藥，具有消腫止痛、清熱解毒、涼肝定驚等功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，重樓所含有的活性成分具有抗癌止血、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、祛痰平喘、止咳抑菌和抗細(xì)胞毒等多種功效[2-5]。重樓是云南白藥、季德勝蛇藥片、宮血寧、熱毒清等著名中成藥的主要原料藥之一[6-7]，市場(chǎng)需求旺盛。重樓中藥材的市場(chǎng)供應(yīng)長(zhǎng)期依賴野外采挖，由于無節(jié)制采挖和生態(tài)環(huán)境惡化，野生重樓資源日漸枯竭，近幾年國(guó)內(nèi)重樓產(chǎn)新呈逐年衰減趨勢(shì)，2019年國(guó)內(nèi)各產(chǎn)區(qū)加起來產(chǎn)新不足400 t，市場(chǎng)需求缺口巨大[8-9]。過去幾年，國(guó)內(nèi)每年需從越南、緬甸、尼泊爾、巴基斯坦等國(guó)進(jìn)口重樓用以補(bǔ)充缺口，但進(jìn)口重樓藥材質(zhì)量良莠不齊，有效成分含量難以達(dá)到新版藥典0.6%的要求[10-11]。隨著國(guó)內(nèi)對(duì)重樓藥材品質(zhì)要求的提高，供需缺口將持續(xù)拉大。從長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮，為了保護(hù)野生重樓植物資源，也為了穩(wěn)定市場(chǎng)供給，大力發(fā)展重樓人工栽培，以家種重樓藥材替代野外采挖已成為必然選擇。

華重樓(Parispolyphyllavar.chinensis)別名蚤休、七葉一枝花[12]，是2020版中國(guó)藥典收載的重樓藥材的基源植物之一[11]。華重樓常規(guī)繁育方式有種子繁殖、根莖營(yíng)養(yǎng)繁殖和組培快繁[13]。自然條件下重樓種子萌芽緩慢、出苗率很低，且種苗質(zhì)量參差不齊[14-16]；根莖繁殖需大量消耗藥材原料，繁殖系數(shù)偏低、成本很高；組培快繁技術(shù)可很好保持母株的優(yōu)良特性，且材料用量少、繁殖效率高，是華重樓繁育技術(shù)研究的理想突破方向[13]。

本實(shí)驗(yàn)擬采用華重樓的成熟種子為外植體，重點(diǎn)探討華重樓種子無菌萌發(fā)過程中的外植體消毒、實(shí)生苗誘導(dǎo)與增殖等問題。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為野生馴化的高稈粉質(zhì)華重樓當(dāng)年新鮮種子，母株栽植于臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院重樓種質(zhì)圃，待蒴果淺裂、種子部分外漏時(shí)采收。

1.2 方法

1.2.1 外植體的取材及預(yù)處理

選擇天氣晴好的上午10點(diǎn)左右采樣，取回的蒴果先用流水反復(fù)沖洗，再用洗滌劑清洗去污，然后剝離種子留作外植體。

1.2.2 外植體的消毒

外植體分別以2%、5%、10% NaClO溶液浸泡5、10、15、20 min，共計(jì)12個(gè)處理，同時(shí)以0.1% HgCl2溶液浸泡外植體10 min作為參照。具體操作流程為：將分離為顆粒的華重樓種子用紗布包裹后在自來水中沖洗1 h，再進(jìn)行表面消毒，之后用無菌蒸餾水沖洗5次，最后用無菌吸水紙吸干表面水分。將經(jīng)過消毒的種子接入附加0.3 mg·L-16-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、0.1 mg·L-11-萘乙酸(NAA)、30 g·L-1蔗糖的MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)28 d，分別統(tǒng)計(jì)外植體污染率和存活率。

污染率=已污染外植體總數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

存活率=存活外植體總數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

1.2.3 實(shí)生苗誘導(dǎo)條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化

以30 g·L-1蔗糖和8 g·L-1瓊脂的基本培養(yǎng)基 (MS)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以種子前處理方式、培養(yǎng)基中6-BA濃度和NAA濃度為參比因子，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，探索適宜于華重樓種子無菌萌發(fā)的培養(yǎng)條件，試驗(yàn)方案見表1。將經(jīng)過外植體消毒后存活下來確認(rèn)無污染的華重樓種子分類處理后接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，25 ℃光照培養(yǎng)，40 d后統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)情況。

表1 實(shí)生苗誘導(dǎo)正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

誘導(dǎo)率=成功誘導(dǎo)出苗的外植體總數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。

1.2.4 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)中如未特別說明，培養(yǎng)條件一律控制在溫度25 ℃，光照強(qiáng)度750～1 500 lx，光照10 h·d-1，空氣相對(duì)濕度50%～70%。

所有培養(yǎng)基配好后均調(diào)pH 5.8，控制溫度121～125 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)全部使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的消毒

外植體消毒前需完全分離，避免簇?fù)沓蓤F(tuán)，消毒處理過程中動(dòng)作輕柔，避免損傷外種皮。消毒試驗(yàn)詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 外植體消毒試驗(yàn)結(jié)果

比較K-1～K-4的消毒效果，可以發(fā)現(xiàn)：當(dāng)NaClO濃度為2%時(shí)(K-1～K-4)，不同處理時(shí)間下消毒效果都不理想，外植體基本全部染菌；當(dāng)NaClO濃度為5%和10%時(shí)(K-5～K-12)，隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)，外植體染菌情況逐步緩解，但是當(dāng)消毒時(shí)間延長(zhǎng)到20 min時(shí)，外植體受消毒劑損傷嚴(yán)重，后期很難恢復(fù)，培養(yǎng)14 d后過半材料變褐凋亡；試驗(yàn)中采用0.1% HgCl2浸泡10 min進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)適宜濃度的HgCl2與NaClO對(duì)華重樓種子的消毒效果大致相當(dāng)。綜合考慮試驗(yàn)可靠性和安全性，最終確定以5% NaClO浸泡15 min作為后續(xù)工作中外植體消毒的首選方法，避免將具有較大毒性和環(huán)境危害風(fēng)險(xiǎn)的HgCl2引入實(shí)驗(yàn)體系。

2.2 實(shí)生苗誘導(dǎo)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)生苗誘導(dǎo)條件正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。將誘導(dǎo)率數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為反正弦值后輸入SPSS 19.0進(jìn)行方差分析得到表4。

表3 實(shí)生苗誘導(dǎo)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 各因素水平間差異顯著性比較(SSR檢驗(yàn))

從表3可以發(fā)現(xiàn)：因素A(種子前處理)間的F=91.841，0.010.05，因素C(NAA用量)間的F=21.159，0.01C>B。進(jìn)一步進(jìn)行各因素水平的多重比較，結(jié)果記入表4。

表4結(jié)果顯示，在重樓種子無菌萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中，人工剝除外種皮和輔以赤霉素溶液浸泡均對(duì)種子無菌萌發(fā)有正向促進(jìn)作用；培養(yǎng)基中適量添加NAA對(duì)種子無菌萌發(fā)也有明顯影響；而6-BA的不同使用水平在實(shí)驗(yàn)中沒表現(xiàn)出差異。綜合以上分析，可以初步確定重樓種子無菌萌發(fā)的較適宜誘導(dǎo)條件為人工剝除外種皮、向培養(yǎng)基中添加0.25 mg·L-1的NAA和0.5 mg·L-1的6-BA。由于上述培養(yǎng)基配方不在正交試驗(yàn)的9種方案之內(nèi)，故進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，剝除外種皮的華重樓種子在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d，實(shí)生苗誘導(dǎo)率接近70%，且華重樓無菌實(shí)生苗在此培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)，可由單葉實(shí)生苗成功誘導(dǎo)出了多芽球莖和多葉大苗(圖1)。

A—華重樓種子無菌萌發(fā)所得實(shí)生苗；B—華重樓實(shí)生苗繼代后二次分化；C—華重樓實(shí)生苗分化出帶有多個(gè)芽原基和根原基的小球莖；D—華重樓實(shí)生苗由單葉小苗分化形成的多葉大苗。圖1 華重樓無菌實(shí)生苗誘導(dǎo)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

隨著野生重樓資源的日趨枯竭，國(guó)內(nèi)重樓中藥材市場(chǎng)的供需失衡現(xiàn)象日漸凸顯。通過發(fā)展重樓人工栽培技術(shù)，一方面可以穩(wěn)定市場(chǎng)供給，另一方面也可保護(hù)野生重樓資源。而重樓人工栽培技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸就在于種苗繁育。相較于種子繁殖和根莖營(yíng)養(yǎng)繁殖，利用組織培養(yǎng)技術(shù)來繁育重樓種苗具有更廣闊的開發(fā)前景[13]。通過誘導(dǎo)重樓種子無菌萌發(fā)獲得實(shí)生苗的周期短，成苗率高，工作中以此為基礎(chǔ)開展重樓組培擴(kuò)繁技術(shù)的深入研究，可一定程度上規(guī)避重樓組培工作取材難、外植體消毒難、初代培養(yǎng)脫分化難等問題。因此，系統(tǒng)研究重樓種子無菌萌發(fā)技術(shù)具有其現(xiàn)實(shí)意義。

本試驗(yàn)在外植體消毒、種子無菌萌發(fā)條件優(yōu)化方面做了一些探索，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過人工剝除外種皮的華重樓種子在后續(xù)培養(yǎng)中啟動(dòng)更快、出苗率更高，且種子褐化少。這對(duì)開展重樓組培擴(kuò)繁技術(shù)的相關(guān)研究具備一定的參考意義。這種現(xiàn)象與筆者在紫薇幼胚培養(yǎng)過程中觀察到的一些現(xiàn)象有相似之處[17]，究其原因可能與種皮中富含的某些成分會(huì)抑制種胚的早期萌發(fā)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)得到如下初步結(jié)論：隨著表面消毒劑作用濃度升高和作用時(shí)間延長(zhǎng)，種子活力會(huì)逐漸喪失，因此，應(yīng)考量表面消毒效果與保持種子活力兩者之間的平衡，實(shí)驗(yàn)中0.1% HgCl2浸泡10 min和5% NaClO浸泡15 min均可滿足工作需要，綜合考慮試驗(yàn)可靠性和安全性，最終選擇以5% NaClO浸泡15 min作為外植體消毒的首選方法，避免將具有較大毒性和環(huán)境危害風(fēng)險(xiǎn)的HgCl2引入實(shí)驗(yàn)體系；人工剝除外種皮和輔以赤霉素溶液浸泡均對(duì)種子無菌萌發(fā)有正向促進(jìn)作用，向培養(yǎng)基中適量添加6-BA、NAA對(duì)種子無菌萌發(fā)也有較明顯影響，本實(shí)驗(yàn)確立的誘導(dǎo)重樓種子無菌萌發(fā)的培養(yǎng)條件為，人工剝除外種皮、向附加30 g·L-1蔗糖和8 g·L-1瓊脂的MS培養(yǎng)基中添加0.25 mg·L-1的NAA和0.5 mg·L-1的6-BA。華重樓種子以此方法離體培養(yǎng)40 d，實(shí)生苗誘導(dǎo)率接近70%，實(shí)生苗在此培養(yǎng)基上連續(xù)傳代培養(yǎng)，可由單葉實(shí)生苗誘導(dǎo)出了多芽球莖和多葉大苗。