脂肪間充質干細胞治療腦癱大鼠的作用機理研究

何正義，鄒征偉，羅耀玲，李林材，屈家陽，賴仲宏，葉俊松

（1.贛南醫學院第一附屬醫院干細胞臨床轉化分中心；2.贛南醫學院第一附屬醫院臨床醫學研究中心；3.贛南醫學院心腦血管疾病防治教育部重點實驗室；4.贛南醫學院江西省醫用組織工程材料與生物制造重點實驗室；5.贛州市干細胞與再生醫學重點實驗室；6.贛南醫學院，贛州 341000)

腦癱會出現肌張力增高、反射亢進等體征，同時肢體出現不同程度的癱瘓，腦癱不僅會給患者一生造成極大的精神和肉體上的痛苦，更給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔[1-2]。據世界衛生組織的數據統計，全球每10萬人中有7人發病，每年有0.5%新生兒發生腦癱。中國現有600多萬腦癱患者，其中12歲以下的腦癱兒童有178萬人，我國6歲以下腦癱患兒數量已超過30萬[3-4]。目前臨床上尚無理想的腦癱治療方法，也無有效藥物，只能依靠綜合治療方法進行早期康復干預。但療程長、見效慢，效果都不理想，即使在功能改善方面也很有限，急需研究新的有效治療方案[5-8]。

干細胞移植后可到達病損部位并分化成神經細胞，能安全和有效地促進中樞神經損傷后的功能恢復[9]。文獻報道脂肪間充質干細胞能夠分化為脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞、成骨細胞、神經細胞等，同時能夠分泌多種生長因子和抗凋亡因子，具有抗炎、抗氧化的功能[10-11]。人體通過抽脂手術就能夠得到大量脂肪間充質干細胞（Adipose-Derived Stem Cells，ADSCs)，獲取途徑方便，倫理影響較小[10]。目前美國多家公司正在利用脂肪間充質干細胞進行腦癱治療并進行臨床一期及二期試驗[10-11]。但脂肪間充質干細胞在腦癱治療作用機理的研究仍然較少，其對腦組織損傷修復機理尚不明確。

Notch信號通路是一種在進化中高度保守的信號通路，研究發現其在生物體神經系統發育和功能維持中起著至關重要的作用[12-16]。目前普遍認為激活Notch信號通路會有利于血管形成的能力和抑制神經細胞凋亡，而抑制Notch信號通路則可促進干細胞向神經系統分化過程[13-14]。但Notch信號通路在脂肪間充質干細胞治療腦癱損傷修復中的具體調控機理尚不清楚。因此，急需研究在腦神經受損后Notch信號通路所發揮作用的機理，以進一步提高干細胞治療腦損傷疾病的作用。

腦癱中以痙攣型腦癱發病率最高，約占全部腦癱病人的70%，病變部位主要是錐體束系統[17]。乙醇能夠導致神經細胞變性、萎縮、凋亡，研究表明通過大鼠腦錐體束注射無水乙醇能夠成功構建大鼠痙攣型腦癱模型[18]，因此本課題擬采用腦錐體束注射無水乙醇法構建腦癱大鼠[19]，研究脂肪間充質干細胞對大鼠腦錐體束損傷的修復作用及運動功能改善的機理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SPF級SD大鼠，體重(270±20)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。實驗嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》中有關規定對動物進行操作和處理。本課題獲得贛南醫學院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F-12(1∶1)及B-27（購于美國Gibco公司）；DAPT、蘇木素、伊紅、水合氯醛（購自北京索萊寶生物科技有限公司）；主要儀器包括二氧化碳培養箱（美國Thermo Fisher科技公司），全自動腦立體定位儀51700型，EG11508型組織包機，RM2255型全自動輪轉切片機，日本OLYM PUS倒置生物顯微鏡，CFX ConnectTM熒光定量PCR系統（美國Bio-Rad公司），流式細胞儀（美國BD公司），CD45抗體（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司），CD44抗體（上海滬震實業有限公司），CD34抗體 （美國Novus Biologicals公司），CD90抗體（上海百塞生物技術股份有限公司），CD146抗體（德國Miltenyi Biotec公司）。

1.2 方法

1.2.1 錐體束注射無水乙醇構建腦癱大鼠模型 取50只SD大鼠按照參照文獻[19]，術前禁食12 h。將大鼠按照每100 g體重1 mL的4%水合氯醛腹腔麻醉。查找腦定位圖譜，用腦定位注射儀定位大鼠腦核團，左側錐體束的立體位置(LPY AP:-12 mm L:0.5 mm H:9.8 mm)，在錐體束部位注射15μL無水乙醇。10只正常對照組大鼠注射生理鹽水（15 μL），留針10 min后緩慢拔針做為假手術正常對照組大鼠。腦癱大鼠造模第6天進行行為學評價，篩選腦癱模型成功制備的大鼠，腦癱模型組和干細胞治療腦癱大鼠組各10只，假手術正常對照組大鼠10只。

1.2.2 大鼠脂肪間充質干細胞的分離、培養及鑒定取60日齡的SD大鼠，使用4%水合氯醛（1 mL/100 g體重）麻醉，70%乙醇消毒皮膚后無菌取出脂肪組織，用含1%青鏈霉素雙抗的D-Hank’s液沖洗3次。將脂肪組織剪碎為液體狀態，加入10 mL胰酶37℃消化90 min。消化完成后，加入10 mL含10%血清的DMEM培養基終止消化，過200目篩網去除大塊組織，以1100 r/min離心4 min，去上清液，加入含10%血清的DMEM培養液重懸細胞后接種到培養瓶中，置于37℃，5%CO2的細胞培養箱內培養。細胞穩定培養24 h后換液，用PBS洗去未貼壁的細胞，更換DMEM培養液繼續培養。干細胞流式細胞儀鑒定：用PBS重懸第5代干細胞稀釋成1×106/mL的細胞懸液，1%的BSA避光封閉30 min，加入CD44、CD90、CD146、CD34、CD45抗體，室溫孵育20 min后PBS沖洗兩遍用流式細胞儀進行檢測。

1.2.3 干細胞尾靜脈注射治療腦癱大鼠 采用胰酶消化法收集第5代大鼠脂肪間充質干細胞，用PBS制成細胞密度為1×106個/mL的單細胞懸液，腦癱大鼠造模成功第7天治療組通過尾靜脈注射1 mL干細胞，對照組和模型組注射1 mL生理鹽水，每周注射一次，連續注射4次。

1.2.4 行為學檢測 造模后第6天進行行為學評價篩選腦癱模型成功制備的大鼠，最后一次注射干細胞后第6天進行行為學評價，分析干細胞對腦癱大鼠運動神經功能的影響。

1.2.4.1 不自主運動 運動正常評價為10分，出現一項異常表現扣2分。異常表現指出現震顫、舞動、抽搐、徐動及痙攣扭動[19]。

1.2.4.2 懸吊試驗 讓實驗鼠前肢扒住水平放置的玻璃棒，記錄其掉落時間。掉落時間小于10 s評分1分，10～30 s，30 s～2 min，2～5 min，大于5 min依次為2、3、4、5分[19]。

1.2.4.3 斜坡試驗 將實驗鼠頭部向下置于45度傾斜度的塑料板上。當實驗鼠轉動身軀與地面夾角超過135度且轉為頭部向上，記錄時間[19]。

1.2.4.4 肌張力測定 滿分為10分：出現肌張力增強扣除4分；減低減去4分；游走性增強減去2分[19]。

1.2.4.5曠場實驗測定 用長寬高分別為36 cm的無蓋塑料方盒制作成運動場地，盒底平均劃分成9個大小相等正方形格子，塑料方盒四周全部涂成黑色。大鼠身體部位大于50%進入相鄰方格計為1分，大鼠后肢站立記為1分，實驗進行30 min后記錄總分[19]。

1.2.5 各組大鼠大腦組織病理學分析 最后一次行為學評價第二天用4%水合氯醛麻醉大鼠，每組各取將5只大鼠固定到手術臺上，剪開右心耳，從左心室插入輸液針頭輸入生理鹽水250 mL沖凈血液，再輸入250 mL多聚甲醛溶液進行固定，取出乙醇注射錐體束部位的腦組織放入4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋后切成5μm厚的切片，做HE染色后中性樹膠封固，顯微鏡下觀察拍照。觀察每個大鼠腦組織同一個位置的切片，并進行圖像分析，測出每張切片中，不重復視野內正常神經細胞、小膠質細胞、纖維束的數目和凋亡細胞數目。

1.2.6 檢測Notch信號通路相關基因 最后一次行為學評價第二天每組各取5只大鼠取錐體束注射部位腦組織提取總RNA，通過RNA反轉錄獲得cDNA。使用熒光定量PCR試劑盒及實時熒光定量PCR儀檢測Notch信號通路相關基因timp1、collagen1、hes1、hey1、jag1、notch1的表達并對結果進行分析。qPCR反應引物如下。見表1。

表1 表格引物序列

1.2.7 統計學分析 實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行處理，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠脂肪間充質干細胞的的分離純化 大鼠脂肪間充質干細胞呈梭形、三角形。換液后48 h細胞呈梭形或扁平型。培養4 d左右，融合度達到80%~90%，細胞呈漩渦狀和放射狀排列，見圖1。

圖1 第5代大鼠脂肪間充質干細胞

2.2 大鼠脂肪間充質干細胞的的分離純化 應用流式細胞儀進行檢測，結果顯示大鼠脂肪間充質干細胞表面標記物鑒定符合標準（99.6%CD44+、99.8%CD90+、98.4%CD146+、99.5%CD34-、98.9%CD45-），見圖2。

圖2 流式鑒定ADSC表型

2.3 行為學評價 腦癱大鼠干細胞治療后與模型組比大鼠姿勢異常（見圖3A）、肌張力得分差異顯著(P<0.05)（見圖3B），步行姿態差異極顯著(P<0.01)（見圖3C），玻璃棒懸吊時間明顯增長，差異極顯著(P<0.01)（見圖3D），提示大鼠肢體運動功能改善明顯。曠場試驗結果差異顯著(P<0.05)（見圖3E），提示大鼠探索能力增加，腦神經改善明顯。

圖3 腦癱大鼠干細胞治療后行為學評價

2.4 大鼠腦錐體束注射乙醇損傷組織HE染色觀察結果 正常對照組大鼠腦錐體束注射乙醇損傷組織做病理切片，HE染色后腦細胞排列規則，無炎性細胞聚積或者局部軟化灶（見圖4A）；腦癱模型組大鼠發現腦神經細胞密度明顯減少，可見小膠質細胞，神經元核固縮、變小變形、壞死崩解，膠質細胞吞噬，腦組織排列紊亂，較多凋亡細胞，可見許多膠質細胞反應性增生性膠質細胞結節，形成大量纖維化結節病變現象，推測模型組腦神經組織未能再生因此就以纖維化形式修復（見圖4B）；干細胞治療組大鼠腦神經細胞再生非常明顯，治療組神經細胞數量約是模型組的2倍，個別細胞固縮、壞死，軸突樹突較多，有少量小膠質細胞無膠原纖維化結節等病變現象（見圖4C），這些結果證實脂肪間充質干細胞能夠有效減輕腦組織損傷，減輕腦神經纖維化修復，能夠促進腦神經再生修復。

圖4 ADSCs治療后大鼠錐體束損傷位置腦組織HE染色病理圖（200×）

2.5 Notch信號通路相關基因表達檢測 與模型組比，治療組大鼠timp1表達量顯著降低（P<0.01），提示干細胞能夠有效減輕腦損傷（見圖5A），collagen1基因表達顯著降低（P<0.001），提示干細胞能夠顯著降低腦神經組織纖維化修復（見圖5B）。hes1基因表達顯著降低（P<0.001）（見圖5C），jag1表達量顯著降低（P<0.05）（見圖5F），hey1基因表達明顯升高（P<0.001）（見圖5D），這些結果提示干細胞通過調控Notch相關基因的表達促進腦癱大鼠腦神經損傷修復，有效減輕腦損傷及纖維化修復。

圖5 脂肪間充質干細胞治療后Notch信號通路相關基因表達量

3 討論

近年來產生了許多治療腦癱的方法，包括藥物治療和物理療法。然而，目前的治療方法并不理想，幾乎沒有有效的治療方法[20]。因此，迫切需要新的腦癱治療策略。

近年來，國內外在臨床上采用干細胞治療腦癱取得了一定成效，大量動物實驗和臨床治療數據已證實干細胞在臨床腦癱治療中有巨大的應用前景[21-24]。Guo[25]等采用慢病毒介導micro RNA-26a(miR-26a)修飾的神經干細胞(NSCs)改善了腦癱大鼠腦組織損傷，抑制了腦組織細胞凋亡。Garza-Bedolla[26]等證實因缺氧缺血性腦病導致嚴重神經功能障礙的患者采用干細胞治療后臨床治療效果明顯改善。Boruczkowski[27]采用間充質干細胞治療小兒腦癱，54例患者中48例(88.9%)的健康狀況有所改善，48例(88.9%)患者生活質量提高，21例(38.9%)患者自理水平提高。脂肪間充質干細胞獲取來源方便，倫理影響小，獲取成本低[28-29]。然而，脂肪間充質干細胞調控中樞神經再生和治療腦癱的具體機制尚未明確，有待深入研究其治療機理，為下一步利用脂肪間充質干細胞高效治療腦癱奠定基礎。

目前，腦癱動物模型的造模方法包括頸總動脈結扎缺氧法、錐體束注射無水乙醇法、宮內感染法、神經毒素法及宮內缺氧缺血法等。但各種腦癱動物模型在模擬腦癱的發病機制、病理改變和臨床表現上都不盡完美[30]。痙攣型腦癱占腦性癱瘓患兒的70%左右，因此本課題采用大鼠錐體束注射乙醇構建痙攣型腦癱大鼠具有重要意義[19]。精確定位注射無水乙醇等試劑的腦癱造模具有多種優點：實驗動物可以選擇成年SD大鼠，成活率高、操作簡單，動物腦癱行為明顯且穩定，一致性比較好，能夠模擬錐體束損傷所致腦癱[19]。通過行為學評價及組織病理學結果證實本實驗成功構建了腦癱大鼠模型。

本實驗通過尾靜脈注射腦癱大鼠發現脂肪間充質干細胞能夠有效改善無水乙醇注射錐體束導致的大鼠腦癱。與模型組比，治療組大鼠玻璃棒懸吊時間明顯增長，步行姿態、姿勢異常、肌張力得分明顯較高，提示大鼠肢體運動功能改善明顯。

組織的損傷修復包括完全再生和不完全再生修復。完全再生是由損傷周圍的同種細胞來修復，再生細胞完全恢復原有組織、細胞的結構和功能。不完全再生修復由纖維組織加以修復以后形成癍痕經纖維組織發生的再生，又稱瘢痕修復，無法恢復原有組織的功能，這種修復是無效修復。一般情況下神經組織再生能力弱，通常會形成為纖維結締組織團。腦損傷部分病理組織分析發現干細胞治療組大鼠腦組織細胞排列明顯比模型組整齊，Timp1與組織損傷程度正相關，通過熒光定量PCR發現治療組大鼠Timp1表達量顯著降低。模型組大鼠腦損傷組織纖維化修復明顯偏多是無效修復，Collagen1與組織纖維化修復相關，而通過熒光定量PCR發現模型組Collagen1明顯偏多，這與病理組織分析結果一致。這些結果表明脂肪間充質干細胞能夠有效治療大鼠腦癱運動功能，促進損傷腦組織完全再生修復，有望恢復神經功能。

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體（DSL蛋白）、CSL（CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合稱）DNA結合蛋白、Notch的調節分子等組成[31]。Notch信號的產生是通過相鄰細胞的Notch配體如Jagged1與受體相互作用，Notch蛋白經過三次剪切，由胞內段（NICD）釋放入胞質，并進入細胞核與轉錄因子CSL結合，形成NICD/CSL轉錄激活復合體，從而激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環-螺旋（basic-helix-loop-helix,BHLH）轉錄抑制因子家族的靶基因，發揮生物學作用[32]。大量研究證實Notch信號通路參與腦神經的再生修復[32]。劉宗秀[13]等報道應用γ-分泌酶抑制劑阻斷Notch信號通路，可減輕局灶性腦缺血再灌注導致的神經元損傷，增加了小鼠大腦缺血再灌注后神經細胞的活力，同時增強了神經干細胞的分化能力。Yang[31]證實激活Notch信號通路會導致神經前體細胞凋亡。Long[32]證實調控Notch信號通路能夠誘導骨髓間充質干細胞向神經元分化。本研究qRT-PCR研究結果顯示，大鼠脂肪間充質干細胞顯著抑制了Notch信號通路中Notch蛋白配體JAG1（P<0.05）的基因表達，HES1基因表達顯著降低（P<0.001），而HEY1基因表達明顯升高（P<0.001）。本研究的結果與前人研究基本一致[32]，推測脂肪間充質干細胞治療后促使Notch信號通路的Notch蛋白配體Jag1、Hes1降低，Hey1升高，從而在促進腦組織損傷的再生修復中發揮重要作用。但Notch1基因表達水平在治療組與模型組差異不顯著，這可能存在著其他信號通路影響，具體機制有待深入研究。

本研究提示，通過調控Notch信號通路可能為脂肪間充質干細胞治療腦癱提供一種新的有前景的治療策略。