金櫻子配方顆粒質量控制研究

李 蕊 張志強 高 揚

(北京康仁堂藥業有限公司，中藥配方顆粒關鍵技術國家地方聯合工程研究中心，北京市中藥配方顆粒工程技術研究中心，北京 101301)

金櫻子為薔薇科植物金櫻子RosalaevigataMichx.的干燥成熟果實。10～11月果實成熟變紅時采收，干燥，除去毛刺。味酸、甘、澀，性平，具有固精縮尿、固崩止帶、澀腸止瀉的功效，用于治療遺精滑精、遺尿尿頻、崩漏帶下、久瀉久痢[1]。研究表明金櫻子具有抗氧化、抗腫瘤、降糖降脂、免疫調節、保護腎臟等多種藥理作用[2，3]。金櫻子中的化學成分有酚酸類、黃酮類、三萜類、多糖類等[4-6]。中藥配方顆粒是在中醫藥理論指導下，采用現代科技手段將傳統中藥飲片按一定的生產工藝制成的提取物與適當輔料或藥材細粉混合后制成的粉狀或顆粒狀產品，解決了傳統中藥飲片難以攜帶、煎煮麻煩等問題，更加適應現代快節奏的生活方式[7]。金櫻子配方顆粒是以金櫻子中藥飲片為原料，經過水煎煮、過濾、濃縮、干燥、制劑等工藝制成。目前，關于金櫻子配方顆粒質量標準的研究較少，現以本企業的配方顆粒為原料，對其質量標準進行研究，以期為金櫻子配方顆粒的質量控制提供依據。

1 材料

儀器：Waters ACQUITY UPLC?H-Class超高效液相色譜儀(PDA Detector檢測器，Empower 3色譜工作站)，ME104E電子天平(梅特勒·托利多)，JY20002電子天平(梅特勒·托利多)，BSA124S電子天平(賽多利斯科技儀器(北京)有限公司)，BT25S電子天平(賽多利斯科技儀器(北京)有限公司)。CAMAG薄層成像系統，DZKW-4恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)，KQ-500DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，硅膠G板(Merck KGaA，銀龍預制板，煙臺市芝罘黃務硅膠開發試驗廠)。

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?HSS T3(2.1×100 mm，1.8 μm)。

試藥：金櫻子配方顆粒K-01、K-02、K-03、K-04、K-05、K-06、K-07、K-08、K-09、K-10、K-11、K-12、K-13、K-14、K-15、K-16、K-17、K-18。

兒茶素對照品(批號：110877-201604，99.2%，中國食品藥品檢定研究院)，沒食子酸對照品(批號：10831-201605，90.8%，中國食品藥品檢定研究院)，原兒茶酸對照品(批號：110809-201205，99.9%，中國食品藥品檢定研究院)，鞣花酸對照品(批號：111959-201903，88.8%，中國食品藥品檢定研究院)，金櫻子對照藥材(批號：121047-201204，中國食品藥品檢定研究院)。

試劑：乙腈(色譜純，Merk)、磷酸(色譜純，Fisher Chemical)；蒸餾水(屈臣氏)；其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 溶液的制備

取金櫻子配方顆粒適量，研細，取1 g，加水20 mL 使溶解，用乙酸乙酯振搖提取兩次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取金櫻子對照藥材1 g，加水50 mL，煮沸30 min，過濾，濾液蒸干，加水20 mL使溶解，同法制成對照藥材溶液。

2.1.2 薄層色譜實驗

照薄層色譜法(中國藥典2015年版四部通則0502)試驗，吸取“2.1.1”項制備的供試品溶液5 μl、對照藥材溶液4 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(5∶5∶1∶0.1)為展開劑，展開、取出、晾干、噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱數分鐘，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，見圖1。

2.2 浸出物、粒度、水分、溶化性測定

浸出物：按照2015年版《中國藥典》中醇溶性浸出物測定法(通則2201)項下的熱浸法測定樣品浸出物的含量，采用乙醇作溶劑。計算得18批金櫻子配方顆粒中浸出物的平均值為44.1%，RSD=4.57%。

粒度：按照2015年版《中國藥典》通則0982中的第二法(雙篩分法)測定樣品的粒度。測得18批次金櫻子配方顆粒不能通過1號篩與能通過5號篩的百分率平均值為6.4%，符合《中國藥典》中顆粒劑項下規定粒度不超過15%的要求。

1-金櫻子配方顆粒(K-01)、2-金櫻子配方顆粒(K-02)、3-金櫻子配方顆粒(K-03)、4-金櫻子配方顆粒(K-04)、5-金櫻子配方顆粒(K-05)、6-金櫻子配方顆粒(K-06)、7-金櫻子配方顆粒(K-07)、8-金櫻子配方顆粒(K-08)、9-金櫻子配方顆粒(K-09)、10-金櫻子配方顆粒(K-10)、11-金櫻子配方顆粒(K-11)、12-金櫻子配方顆粒(K-12)、13-金櫻子配方顆粒(K-13)、14-金櫻子配方顆粒(K-14)、15-金櫻子配方顆粒(K-15)、16-金櫻子配方顆粒(K-16)、17-金櫻子配方顆粒(K-17)、18-金櫻子配方顆粒(K-18)、DY-金櫻子對照藥材121047-20104

水分：按照2015年版《中國藥典》通則0832中的第二法(水分測定)進行檢查，計算得18批次金櫻子配方顆粒中的平均水分為6.5%，RSD=3.9%，符合《中國藥典》中顆粒劑項下不超過8%的要求。

溶化性：取18批金櫻子配方顆粒，每批10 g,加熱水200 mL，攪拌5 min，觀察到顆粒全部溶化，說明該顆粒的溶化性符合要求。

2.3 含量測定方法的建立

2.3.1 色譜條件與專屬性試驗

選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長為100 mm，內徑為2.1 mm，粒徑為1.8 μm)的色譜柱，以乙腈為流動相A，0.1%磷酸為流動相B，按表1進行梯度洗脫；流速為每分鐘0.3 mL，柱溫為30 ℃，檢測波長為220 nm，進樣量：1 μl，理論板數按兒茶素峰計算應不低于7 500，色譜圖見圖2。

表1 梯度洗脫表

圖2 陰性對照(A)、對照品(B)和供試品(C)溶液測定的專屬性試驗色譜圖

2.3.2 對照品溶液的制備

取兒茶素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL 含35 μg兒茶素的溶液，即得對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

取金櫻子配方顆粒，研細，取約0.25 g，精密稱定，精密加水25 mL，使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取濾液，即得供試品溶液。

2.3.4 方法學考察

精密度試驗：取35.44 μg/mL兒茶素對照品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下連續進樣6次，記錄峰面積，計算得峰面積的RSD=2.3%，表明儀器的精密度良好。

重復性試驗：取同一批樣品(批號：200424-331100-17)，按“2.3.3”項方法制備6份供試品溶液，分別進行測定，計算得兒茶素含量的平均值為1.10 mg/g，RSD=2.5%，表明該方法的重復性良好。

穩定性試驗：取同一批樣品(批號：200424-331100-17)，按“2.3.3”項方法制備1份供試品溶液，“2.3.1”項色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進行測定，記錄峰面積，計算得峰面積的RSD=1.1%，表明供試品溶液在24 h內的穩定性較好。

線性試驗：取兒茶素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.207 28 mg兒茶素的溶液，作為兒茶素對照品母液；分別精密吸取對照品母液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，過濾，精密吸取上述溶液各1 μL，注入高效液相色譜儀(UPLC)，按“2.3.1”所述方法測定兒茶素色譜峰峰面積，以兒茶素色譜峰的峰面積為縱坐標，兒茶素的濃度為橫坐標，最終求得回歸方程為y=11 699 294.382 0x+2 993.583 0，R2=0.999 6，其線性范圍為0.020 7～0.207 3 mg/mL-1。該范圍內兒茶素線性關系良好。

加樣回收試驗：精密稱取兒茶素對照品1.383 mg、2.765 mg、3.947 mg，分別置于500 mL容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，作為對照品溶液。取已知含量的樣品粉末，精密稱取9份，每份0.1 g，分別按照0.5∶1、1∶1、1.5∶1的量加入對照品，即分別加入25 mL對照品溶液，精密稱取金櫻子配方顆粒約0.125 g,其余按“2.3.3”項方法制備供試品溶液，分別進行測定，計算回收率及RSD。金櫻子配方顆粒中兒茶素的回收率均值為100.22%，RSD=2.6%，表明方法的回收率良好，檢測結果準確可靠，見表2。

表2 加樣回收實驗的結果表

2.3.5 樣品測定

取18批金櫻子配方顆粒，按“2.3.3”項方法制備供試品溶液，并按“2.3.1”項色譜條件分別進樣檢測，計算每次樣品中兒茶素的含量。18批樣品中兒茶素的含量分別為：2.67 mg/g、1.83 mg/g、2.09 mg/g、2.40 mg/g、0.85 mg/g、2.05 mg/g、2.10 mg/g、1.85 mg/g、2.30 mg/g、2.13 mg/g、1.09 mg/g、1.04 mg/g、0.69 mg/g、0.72 mg/g、0.80 mg/g、0.74 mg/g、1.24 mg/g、0.67 mg/g，平均值為1.51 mg/g。

2.4 特征圖譜的建立

2.4.1 色譜條件與系統適用性

按“2.3.1”項色譜條件進行。

2.4.2 參照物溶液的制備

取兒茶素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL 含35 μg兒茶素的溶液，另取沒食子酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL含2.5 μg沒食子酸的溶液，另取原兒茶酸、鞣花酸對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成1 mL含4 μg目標對照品的溶液，作為對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備

按“2.3.3”項方法制備18批金櫻子配方顆粒供試品溶液。

2.4.4 共有峰的標定及特征峰的指認

按“2.3.1”項色譜條件，分別取“2.4.2”的對照品溶液及“2.4.3”的供試品溶液，注入超高效液相色譜儀，進行測定，得到18批金櫻子配方顆粒的UPLC圖譜，18批樣品共確認共有峰5個，其中1號峰為沒食子酸，2號峰為原兒茶酸，4號峰為兒茶素，5號峰為鞣花酸，其中4號峰兒茶素峰保留時間適中，峰面積較大，分離度較好，確定為S峰(見圖3)。

(A) 沒食子酸對照品；(B) 原兒茶酸對照品；(C) 兒茶素對照品；(D) 鞣花酸對照品；(E) 金櫻子配方顆粒

2.4.5 指紋圖譜的建立

采用藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)對18批金櫻子配方顆粒的UPLC圖譜進行處理，并生成對照圖譜，見圖4。

圖4 (A) 18批金櫻子配方顆粒指紋圖譜、(B)對照圖譜

以4號峰為S峰，各峰的相對保留時間見表3。為了保證金櫻子配方顆粒的質量，按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)計算，規定供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度不低于0.90。18批金櫻子配方顆粒與對照指紋圖譜的相似度分別為：0.997、0.991、0.995、0.990、0.993、0.970、0.968、0.998、0.994、0.972、0.961、0.981、0.970、0.968、0.962、0.983、0.965。

各批金櫻子配方顆粒與對照指紋圖譜的相似度均較高，滿足規定要求。

表3 18批金櫻子配方顆粒相對保留時間結果表

3 討論

中藥配方顆粒遵循中醫基本理論的指導，運用現代制藥工藝，將符合炮制規范的單味中藥飲片經過加工煎煮、過濾濃縮、噴霧干燥等程序，制備成供中醫臨床上可隨機組方、即沖即飲的顆粒劑型。其保留了原中藥飲片的藥性藥效，具有無需煎煮，易于調劑，便于攜帶、運輸、儲存、服用等優點。通過大量的臨床觀察，其療效顯著，與傳統湯劑藥效基本一致。中藥配方顆粒的療效得到認可，但是國內的中藥配方顆粒生產工藝、質量標準不統一，市場流通產品規格不同、質量差異較大。因此，建立統一的中藥配方顆粒標準和生產質量管理規范至關重要。

金櫻子配方顆粒薄層鑒別參考《中國藥典》2015版中金櫻子項下的鑒別方法，并且對方法進行了優化處理，結果供試品與對照藥材均可得到對應的清晰斑點，說明金櫻子配方顆粒中有效成分的含量穩定可控。

對其浸出物含量進行了測定，并檢查了水分、粒度、溶化性。浸出物的平均值為44.1%，粒度、水分、溶化性均符合《中國藥典》2015版中顆粒劑項下的相關規定要求。

金櫻子具有抗氧化、抗腫瘤、降糖降脂、免疫調節、保護腎臟等多種藥理作用[8]，有研究表明金櫻子的多酚類成分能降低小鼠血清中血清膽固醇TC、三酰甘油TG、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C的含量，升高高密度脂蛋白膽固醇HDL-C的含量，抑制肥胖小鼠的體重增長。本研究建立了多酚類成分兒茶素含量測定的UPLC方法，并進行了方法學考察，結果表明：該方法準確可靠、穩定性好。同時采用該方法對18批次金櫻子配方顆粒中兒茶素的含量進行了檢測，計算得到18批樣品中兒茶素含量的平均值為1.51 mg/g。中藥指紋圖譜是對某種或某產地的中藥材或中成藥進行分析，獲得的能夠表征中藥材或中成藥特性的共有峰的圖譜，能較為全面地反映出中藥所含化學成分的種類和含量，便于質量控制[9，10]。由18批金櫻子配方顆粒的UPLC指紋圖譜可見，其相似度均大于0.90，并指認了沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、鞣花酸峰的歸屬，該指紋圖譜相似度高、穩定性好，可用于金櫻子配方顆粒的質量控制。